首先，请确保标液按证书上建议的保存条件进行保存，保证化合物的稳定。溶剂挥发、化合物分解等各种因素会使标准溶液的浓度标准值发生改变，造成后续使用时定值不准。因此远慕生物建议：1、标液原液原则上不建议多次或者长期使用，最好是一次性配制成储备液。如需多次或长期使用，请分装成可供单次使用的包装、在证书条件下保存，最重要的是，尽快用完！2、贮备液、工作液分装成可供单次使用的包装、在证书条件下保存为宜；3、化学性质不稳定的化合物，工作溶液现配现用；4、分装需使用密封性好、化学稳定性好的储存瓶或进样瓶：● 化合物性质比较不稳定，建议选择棕色瓶身；● 如需较长时间保存，瓶身材质可选择中高硼硅玻璃材质避免杂质溶出；● 瓶盖密封性钳口>螺口>卡口；● 勿选预切口的瓶盖垫。5、分装好后，瓶中剩余空间小于三分之一，减少溶剂挥发也避免溶液过满接触到盖子造成杂质溶出。6、分装好的溶液瓶口朝上放置，盖紧瓶盖后用封口膜或者铝箔密封。

pH计,酸度计主要指实验室酸度计,主要分为台式pH计|酸度计，便携式pH计|酸度计，笔式pH计|酸度计三大类别。一、pH计|酸度计原理用pH计|酸度计进行电位测量是测量pH最精密的方法。pH计|酸度计由三个部件构成：1.一个参比电极；2.一个玻璃电极，其电位取决于周围溶液的pH值；3.一个电流计，该电流计能在电阻极大的电路中测量出微小的电位差。由于采用最新的电极设计和固体电路技术，现在最好的pH计|酸度计可分辨出0.005pH单位。参比电极的基本功能是维持一个恒定的电位，作为测量各种偏离电位的对照。银-氧化银电极是目前pH计|酸度计中最常用的参比电极。玻璃电极的功能是建立一个对所测量溶液的氢离子活度发生变化作出反应的电位差。把对pH敏感的电极和参比电极放在同一溶液中，就组成一个原电池，该电池的电位是玻璃电极和参比电极电位的代数和。E电池＝E参比+E玻璃，如果温度恒定，这个电池的电位随待测溶液的pH值变化而变化，而测量pH计|酸度计中的电池产生的电位是困难的，因其电动势非常小，且电路的阻抗又非常大1－100MΩ；因此，必须把信号放大，使其足以推动标准毫伏表或毫安表。电流计的功能就是将原电池的电位放大若干倍，放大了的信号通过电表显示出，电表指针偏转的程度表示其推动的信号的强度，为了使用上的需要，PH计|酸度计电流表的表盘刻有相应的pH数值；而数字式pH计|酸度计则直接以数字显出pH值。二、pH计|酸度计调试实验室常用的pH计|酸度计有老式的国产雷磁25型酸度计最小分度0.1单位和pHS-2型PH计|酸度计最小分度0.02单位，这类pH计|酸度计的pH值是以电表指针显示。新式数字式pH计|酸度计有国产的科立龙公司的KL系列，其设定温度和pH值都在屏幕上以数字的形式显示。无论哪种pH计|酸度计在使用前均需用标准缓冲液进行二重点校对。首先阅读仪器使用说明书，接通电源，安装电极。在小烧杯中加入pH值为7.0的标准缓冲液，将电极浸入，轻轻摇动烧杯，使电极所接触的溶液均匀。按不同的pH计|酸度计所附的说明书读取溶液的pH值，校对pH计|酸度计，使其读数与标准缓冲液pH7.0的实际值相同并稳定；然后再将电极从溶液中取出并用蒸馏水充分淋洗，将小烧杯中换入pH4.01或0.01的标准缓冲液，把电极浸入，重复上述步骤使其读数稳定。这样就完成了二重点校正；校正完毕，用蒸馏水冲洗电极和烧杯。校正后切勿再旋转定位调节器，否则必须重新校正。三、pH计|酸度计的使用所测溶液的温度应与标准缓冲液的温度相同。因此，使用前必须调节温度调节器或斜率调节旋钮。先进的pH计|酸度计在线路中安插有温度补偿系统，仪器经初次较正后，能自动调整温度变化。测量时，先用蒸馏水冲洗两电极，用滤纸轻轻吸干电极上残余的溶液，或用待测液洗电极。然后，将电极浸入盛有待测溶液的烧杯中，轻轻摇动烧杯，使溶液均匀，按下读数开关，指针所指的数值即为待测溶液的pH值，重复几次，直到数值不变数字式pH计|酸度计在约10s内数值变化少于0.01pH值时，表明已达到稳定读数。测量完毕，关闭电源，冲洗电极，玻璃电极要浸泡在蒸馏水中。四、pH计|酸度计的保养玻璃电极在初次使用前，必须在蒸馏水中浸泡一昼夜以上，平时也应浸泡在蒸馏水中以备随时使用。玻璃电极不要与强吸水溶剂接触太久，在强碱溶液中使用应尽快操作，用毕立即用水洗净，玻璃电极球泡膜很薄，不能与玻璃杯及硬物相碰；玻璃膜沾上油污时，应先用酒精，再用四氯化碳或乙醚，最后用酒精浸泡，再用蒸馏水洗净。如测定含蛋白质的溶液的pH时，电极表面被蛋白质污染，导致读数不可靠，也不稳定，出现误差，这时可将电极浸泡在稀HCl（0.1mol/L）中4－6分钟来矫正。电极清洗后只能用滤纸轻轻吸干，切勿用织物擦抹，这会使电极产生静电荷而导致读数错误。甘汞电极在使用时，注意电极内要充满氯化钾溶液，应无气泡，防止断路。应有少许氯化钾结晶存在，以使溶液保持饱和状态，使用时拨去电极上顶端的橡皮塞，从毛细管中流出少量的氯化钾溶液，使测定结果可靠。另外，pH测定的准确性取决于标准缓冲液的准确性。酸度计用的标准缓冲液，要求有较大的稳定性，较小的温度依赖性。五、PH计数字不稳定现象原因总结1、检查电极是否已损坏；2、应该是电极使用的时间太长了，先校准看一下是否有效；3、可试下用2.5MMOL/L的KCL溶液浸泡探头；4、清洗一下玻璃球，是不是时间长了，上面附着了一些有机物，导致反应不灵敏；5、在水中存在着一个化学平衡~CO2 + H2O→H+ + HCO3-，由于一般的纯水或地表水都显弱碱性导致该平衡向正反应方向移动故PH会一直上升~个人觉得是这样的；6、在被测水样中加入中性盐（如Kcl）作为离子强度调节剂，改变溶液中的离子总强度，增加导电性，使测量快速稳定。此方法国家标准GB/T6P04.3—93中规定："测量水样时为了减少液接电位的影响和快速达到稳定，每50ml水样中加入一滴中性0.1moL/LKCL溶液。"虽然此方法改变了水样中的离子强度，在一定程度上引起了其PH值得变化，但经实验证明此变化在数值上只改变了0.01pH左右，是完全可以接受的。但采用这种方法时，一定要注意所加的Kcl溶液不应含任何碱性或酸性的杂质。因此，Kcl试剂要采用高纯度的，所配溶液的水质也要高纯度的中性水质；7、在测定时，吸收CO2，PH不断上升；8、pH计测pH值，原理是有指示电极和参比电极而构成的电极插入到溶液中形成原电池,?在室温(25℃)时每单位PH值相当于59.1mv的电动势变化值,在仪器上直接以pH的读数表示,温差在仪器上有补偿装置.因为纯净水的离子很少，不能形成稳定的原电池，所以在被测水样中加入中性盐（如KCl）作为离子强度调节剂，改变溶液中的离子总强度，增加导电性，使测量快速稳定；9、ph计读数不稳定：被测定溶液是酸性用pH=4的缓冲液校正斜率，测定溶液是碱性用pH=9的缓冲液校正斜率．调斜率的溶液pH越接近被测溶液的pH值越好；10、有可能是接触不良；11、感觉pH计如果轻微晃动的话，读数也会变的；12、应该不是电极的原因，我想是你的电极干了，你自己看看，一般电极上面都有个小洞，里面装些3mol/LKCL就应该搞定了；13、电极在使用过程中pH值不稳定 基本上和校正没有关系，它与电源电压波动、电极的性能、电极的引导线、电极插孔的接触、被测定溶液的温度等有关。在校正时候，如果被测定溶液接近酸性，就用“6‘定位，如果是碱性的就要用”9“定位了。两者不能任意选；14、应该是电极的问题，使用前先活化。并且，电极不管使用不使用，一年都要淘汰了。测偏酸性溶液，用接近4和7的缓冲液校正；测偏碱性的溶液则应用7和10的缓冲液校正；15、纯净水的pH直用pH计测的出来才怪，首先 用弄明白pH计的测定原理啊:是通过水中含有的离子在电极的作用下定向移动形成电流而显示读数，纯进水的离子太少,电解率低,怎么会测的稳定；16、可能是接触不良.或是电极浸泡液(3MOL/L的KCL溶液)少了,未将电极完全浸泡在电极浸泡液中.还有就是电极老化了,或该换了；17、我想跟室温有关,温度偏低时或者空气流动快,都会影响pH计,要保持室温稳定,而且测定时要把门和窗关好；18、如果测纯水，不稳定是正常的，本来里面含的离子少，缓冲能力弱，环境对它影响十分大，一般取个相对稳定的值就可以了。

　　下面的操作方法可以使约3~5分子的生物素与1分子的蛋白结合，对某些蛋白来说，生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。　　1.   溶解2~10 mg 蛋白于1 ml 的BuphTm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。如果蛋白含有不恰当的缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。　　2.  在打开之前，平衡生物素至室温。加2 mg Sulfo-NHS-Biotin于100 ul 超纯水中，加入足够量浓度的生物素，一般对于10 mg/ml 蛋白来说超过12倍分子数，对于2 mg/ml 蛋白溶液应超过20倍，或者该试剂也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中　　3.  室温30分钟，或冰上放置2小时。　　4.  用30 ml PBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5 ml 或1 ml 于单独的管中。　　5.  以280 nm 的吸收值测定蛋白含量。　　6.  生物素化的蛋白4℃存放至使用，可加入叠氮钠、甘油等保存。　　HABA法检测生物素标记效果　　试剂配制：　　1.  PBS（100 mM 磷酸盐，150 mM Nacl　pH7.2）　　2.  HABA/亲和素溶液：10 mg 亲和素、600 ul10 mM　HABA于19.4 ml 的PBS中，该溶液的A500大约在0.9~1.3之间，溶液于4℃保存可稳定2周。如果有沉淀形成（HABA溶液）可过滤后使用。　　比色法检测生物素/蛋白质摩尔质量比：　　1.  吸取900 ul　HABA/亲和素溶液于1ml比色杯。　　2.  测定该溶液在500 nm 处的吸收值并记录为“A500　HABA/Avidin”。　　3.  吸取100 ul 生物素标记的蛋白于杯中并测定500 nm 的吸光度值，记为A500　HABA/Avidin/Biotin （数值必须恒定15s 以上）如果A500　HABA/Avidin/Biotin的值不超过（≤）0.3，重新稀释待测样品并检测。　　注：计算结果时必须考虑稀释度。　　4.  计算Biotin/Protein摩尔比　　①A=生物素化的蛋白毫摩尔浓度＝蛋白浓度（mg/ml）/蛋白的分子量　　②B=500nm处的吸光度变化 △A500=（0.9×A500HABA/Avidin）-A500HABA/Avidin/Biotin　　③C=生物素的毫摩尔浓度=mmol Biotin/ml反应溶液=△A500/（34,000×光程）　　④Biotin/Protein摩尔比=C•10•稀释倍数/

牛血清白蛋白是血液中的主要成分（38g/100ml），分子量68kD，等电点4.8，含氮量16%，含糖量0.08%，仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。牛血清蛋白溶液可以作为测量蛋白质含量的标准曲线用。一般买回来的牛血清蛋白是细小片状的乳白色粉末。牛的血清蛋白也以铁为基本原料。1、特纯级牛血清蛋白用途：用作酶标、金标等诊断试剂的封闭剂，生化试验等。电场対超感牛血清白蛋白截留率的影响性状：淡黄色干燥粉末2、无脂肪酸牛血清蛋白用途：用作酶标、金标等诊断试剂的封闭剂、保护剂，尤其适用于容易受脂肪酸影响的产品和试验。性状：淡黄色干燥粉末3、无蛋白酶牛血清蛋白用途：用于酶标、金标等诊断试剂的封闭剂、保护剂，尤其适合血液脂类的诊断试验、脂类诊断试剂及对纯度要求高的产品。性状：淡黄色干燥粉末4、细胞培养级牛血清蛋白用途：无血清培养基的蛋白添加剂，供细胞培养使用。性状：淡黄色干燥粉末白蛋白

  凝胶层析分离物质的优缺点  1.凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质—凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。  2.分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100%。  3.分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响。  4.应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很宽，如SephadexG类为102～105d；Sepharose类为105～108d。  5.分辨率不高，分离操作较慢。由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分离时流速必须严格把握。因而分离操作一般较慢。而且对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象。  凝胶层析的应用  ⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。  ⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。  ⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的的分子量。  ⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。

生物素，是一个分子量只有244.31Da的小分子，经活化后可与蛋白、抗体等生物大分子结合，不仅可以很好地保持大分子的生物活性，而且与亲和素结合使用时具有多级放大作用，使其广泛应用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究。那么如何使用生物素标记抗体或蛋白呢？下面远慕给大家分享一下。工具/原料1. 10ul，50ul，200ul，1000ul可调高精度移液器2. 恒温箱（37℃）3. 离心机（离心力可达到12,000×g）4.生物素标记试剂盒（Cata.No:EBLK0002, Elabscience)实验前准备1.仔细阅读使用说明书。2.计算待使用NH2-Reactive Biotin的量。3.提前20min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温（注：不需要用到的NH2-Reactive Biotin继续放置冰箱中）。4.溶解NH2-Reactive Biotin：加入30ulDMF至NH2-ReactiveBiotin瓶中，静置10min，待其充分溶解，此时生物素的浓度为10mM。操作步骤：（本操作步骤按照1mg的量进行标记）1.取1mg待标记抗体于Filtration tube中，并加入相应体积的Labeling Buffer，使抗体的终浓度为2mg/ml，12,000 x g离心10min。（注：①Filtration tube的最大体积为0.5ml②待标记抗体浓度低时，可先超滤离心一次）2. 加入13.3ul NH2-Reactive Biotin 和适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使终体积为0.5ml，并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光温育30min。12,000 x g离心10min。3. 加入适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使终体积为0.5ml，并轻轻吹打混匀，12,000 x g离心10min。4. 操作3重复一次。5. 加0.2ml Labeling Buffer至Filtration tube中，轻轻吹打。将滤芯倒转放置于另一个离心管中，6,000 x g离心10min。6. 收集离心管中的溶液，即为生物素标记的抗体。

　　DAB染色液用于免疫组化染色，应用在Dako 自动染色系统上。　　DAB染色液的使用方法　　1.DAB显色液配制　　10mM Tris-HCl (pH7.6)   9mL  +DAB (diaminobezidin 3，3-二氨基联苯胺) +0.3%(W/V)  NiCl2 或CoCl2   1mL ,显色时加入5-10mL 30%H2O2 混匀后立即使用　　2. 显色　　准备好含有待测蛋白的固相膜：包括电泳、转印、封阻、一抗（或生物素）处理、辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗（或链霉亲和素）处理、清洗等步骤。　　3.加入适量的DAB显色液，铺满整个固相膜表面（可按比例增减）。　　4. 置于平式摇荡仪上，在室温下孵育2至5分 钟，避免光照（暗室操作），直至棕褐色沉淀出现。　　5.用镊子夹起固相膜，放进无离子水里清洗。　　6.空气中晾干。　　7. 拍照记录 。　　DAB染色液的注意事项　　1． DAB溶液应低温密封保存。如有结晶析出，应确保结晶完全溶解再行使用；　　2． 显色工作液应现用现配，新鲜配制的工作液应为无色或浅棕色，如颜色过深，请勿使用；　　3． DAB在常温下不稳定，每次取用后均应及时加盖密封放回冰箱，以免因DAB分解影响实验，或因渗漏造成实验环境污染；　　4． DAB有潜在致突变作用，操作时应注意穿戴好防护用具。

辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP），是临床检验试剂中的常用酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类（ELISA）试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP）比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多个同工酶组成，分子量为40,000，等电点为pH3～9，酶催化的最适pH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl）表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右（最高可达3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。用途（1） RZ＞3 活性 ＞250u/mg， 主要应用于免疫学，是高纯度的过氧化酶。采用特殊色谱纯化技术以除去会影响免疫学反应的同工酶B .（2） RZ＞2 活性 ＞180u/mg ，主要应用于临床化学，我们的客户也有将这个规格的产品应用于免疫学研究的。此时，一个标准化的分析方法就变得尤为重要。（3） RZ＞1 活性 ＞100u/mg，主要应用于血糖试纸和尿液分析试纸。（4） RZ＞0.6 活性 ＞60u/mg ，主要应用于尿液分析试纸。

昆虫表达体系是四大蛋白表达系统（原核细胞，酵母，昆虫细胞，真核哺乳动物表达体系）之一。昆虫表达系统的原理是通过将转移载体中的表达组件转座到大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体上，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。将病毒上清侵染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。昆虫表达体系有很多优点：1、具有糖基化，乙酰化，磷酸化作用等蛋白翻译加工修饰；2、易于操作。杆状病毒基因组较小，分子生物学特性简单；3、昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养；4、可表达较大的外源性基因而不影响本身增殖；5、可以高效表达外源基因。一、常见的蛋白表达系统为了表达和纯化目的蛋白，常见的蛋白表达体系包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞表达系统和体外翻译体系等，其中实验室中比较常用的是大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达细胞。大肠杆菌可以表达一些对于翻译后修饰没有什么要求的蛋白，操作最简单便捷，适合低成本大量表达目的蛋白；昆虫细胞可以表达一些需要简单的糖基化修饰等的蛋白，操作比大肠杆菌复杂但比哺乳动物细胞要简单一些，目的蛋白的表达纯化的成本高于大肠杆菌但低于哺乳动物细胞；哺乳动物细胞适合表达需要复杂翻译后修饰的蛋白，目的蛋白的表达纯化的成本相对较高。体外翻译系统大多用于蛋白翻译的研究，仅在特殊情况下才会用于目的蛋白的表达和纯化；酵母用于目的蛋白的表达和纯化相对比较常见一些，其中获得的蛋白的修饰程度和成本介于大肠杆菌和昆虫表达系统之间。昆虫或者哺乳动物表达系统，相当于把生物体作为了反应器，用于表达和纯化所需的目的蛋白。产品中包含了大肠杆菌蛋白表达纯化系统、昆虫细胞蛋白表达纯化系统和哺乳动物蛋白表达纯化系统。提供的大肠杆菌蛋白表达纯化系统主要采用pET系列质粒，转化到BL21系列等菌株中，进行目的蛋白的表达，后续使用镍柱或GST柱进行目的蛋白的纯化。该系统不仅适合小量目的蛋白的表达纯化，也适合较大量的目的蛋白的表达纯化。昆虫蛋白表达纯化系统，可以采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统, 通过LipoInsect?转染试剂感染Sf9等昆虫细胞，最终通过镍柱、GST柱等方法进行目的蛋白的表达和纯化。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是由Luckow等人于1993年发展的一种快速有效产生重组杆状病毒的方法，也是到目前为止使用最为广泛的昆虫表达系统。哺乳细胞表达系统包括小量目的蛋白的表达纯化和大量目的蛋白的表达纯化两种。进行小量目的蛋白的表达纯化时，通常可以采用pCMV等系列真核表达载体，使用脂质体或磷酸钙等转染试剂转染细胞后，进行目的蛋白的表达，随后可以采用目的蛋白抗体或所带的标签抗体进行免疫沉淀，也可以考虑采用镍柱或GST柱进行目的蛋白的纯化；进行大量目的蛋白的表达纯化时，可采用Lipo293F?转染试剂大量转染293f细胞，从而实现大规模的蛋白表达与后续的纯化。二、昆虫蛋白表达和纯化系统昆虫杆状病毒表达载体系统(Baculovirus Expression Vector Systems, BEVS)是一个二元系统。第一个部分是病毒感染的昆虫宿主，通常是鳞翅目昆虫细胞系，有时也可以是鳞翅目的昆虫。第二个部分是杆状病毒表达载体，其功能是将编码目标蛋白的外源基因导入宿主细胞中、组装杆状病毒并进行目的蛋白的表达。1.昆虫细胞鳞翅目昆虫(Order Lepidoptera)包括蛾(moth)和蝴蝶(butterfly)，它们是杆状病毒家族中多种病毒的宿主。目前已经建立了超过250种的昆虫细胞株。杆状病毒表达载体涉及的最常用的鳞翅类昆虫细胞株有两个，其中一个是Sf9, 由Smith和 Summers在1987年亚克隆IPLB-SF-21而建立的。IPLB-SF-21细胞系是在1977年从草地贪夜蛾(又称为秋天行军虫)蛹的卵巢组织中分离出来的；另外一个是HighFive, 最初是从粉纹夜蛾(又称为甘蓝银纹夜蛾)(cabbageIooper)的成熟卵巢组织中分离到的细胞株。Sf9/Sf21和HighFive两种细胞系都能以贴壁或悬浮状态生长。通过感染在培养板或培养瓶中生长的 Sf9/Sf21或 HighFive细胞，可以很方便地实现实验室规模的蛋白质生产的目的。昆虫细胞培养的条件和方法与哺乳动物细胞的培养方法不太一样，昆虫细胞的培养温度是25-30℃，最适温度是28℃而不是37℃；另外，Sf9/ Sf21和HighFive细胞贴壁不紧, 在传代培养时不需要EDTA或胰酶(trypsin)处理；昆虫细胞的生长也不需要CO2培养箱，因为昆虫细胞培养液通常是用磷酸盐而不是碳酸盐作为缓冲液。Sf9/Sf21和HighFive细胞都可以在有或没有血清的培养液中生长。多种不同的昆虫细胞培养液都能够从多个不同的制造商买到，其中包括ExpressionSystems、Invitrogen(GIB-CO)、HyClone和Sigma-Aldrich。有血清培养液主要有Grace's insect cell culture medium，TNM-FH，IPL-41,TC-100和Schneider's insect medium等，而无血清培养液主要有SF-900II SFM，SF-900III SFM和Express-Five SFM等特别适合蛋白的大规模表达。需要指出的是，Sf9/Sf21和HighFive细胞都会倾向于逐渐适应某种特定的培养液，如果突然将它们的培养液从有血清培养液变为无血清培养液时往往会导致培养细胞的损失。因此通常建议采用"缓慢培养液更换法"，如在连续传代中，应该将无血清培养液的比例从0% 依次升高至25%、50%、75%，直至100%。即使使用这种相对缓慢的血清戒除法，当将细胞刚刚置于不含血清的培养液时，这些细胞也会经历短暂的生长停止或生长缓慢，但这些细胞会在新培养液中缓慢生长12天后恢复至正常的生长速率。"缓慢培养液更换法"不仅可实现从有血清培养液到无血清培养液的转换，还可以用于将昆虫细胞从一种无血清培养液转移到另一种无血清培养液。昆虫细胞可作为杆状病毒感宿主而进行高水平的外源蛋白的表达，来自昆虫杆状病毒表达系统的重组蛋白通常具有正确的翻译后修饰和生物学活性，其翻译后蛋白修饰状态与哺乳动物类似，当然这种加工与哺乳动物细胞对蛋白质的加工并不总是相同，比较明显的一个例子就是蛋白的N-糖基化修饰有所不同。Invitrogen将一个最初命名为SfSWT-I的源于Sf9细胞的转基因昆虫细胞系命名为Mimic Sf9, 该细胞系具有更完整的N-糖基化途径，在含有血清的培养液中能够表达出人源化的重组糖蛋白。2. 昆虫杆状病毒表达系统与大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞等其它常用的重组蛋白表达系统相比，昆虫杆状病毒表达系统具有以下独特的优点：(1) 与大肠杆菌表达系统相比，对于某些容易在大肠杆菌表达系统中由于二硫键错误配对或者缺乏蛋白翻译后修饰(如磷酸化和糖基化等)而形成包涵体的蛋白，在大多数情况下，在昆虫表达系统中高水平表达的重组蛋白往往可溶，而且能折叠正确，并且含有对某些蛋白活力所必须的翻译后修饰(如磷酸化和糖基化等)。(2) 与酵母和哺乳动物表达系统等其它真核表达系统相比，外源基因表达水平高，非常适应大规模表达所需的高密度悬浮培养，而且比较容易分离纯化。(3) 昆虫细胞由于悬浮生长，容易进行放大培养，从而可进行大规模的重组蛋白表达纯化，昆虫杆状病毒表达系统广泛应用于科研和工业生产领域，重组蛋白产量最高可达1g/L。(4) 昆虫细胞可用于同时表达多种重组蛋白，可通过多种重组病毒同时感染昆虫细胞或用含有多个表达框的一种病毒感染昆虫细胞来实现。所以该系统特别适合表达多亚基的蛋白复合物以进行蛋白的结构功能研究等。(5) 生物安全性高。昆虫杆状病毒具有严格的宿主范围，通常仅限于非脊椎动物，因此具有生物安全性高这一特点。3. Bac-to-Bac杆状病毒表达系统Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是由Luckow等人于1993年发展的一种快速有效产生重组杆状病毒的方法，也是到目前为止使用最为广泛的昆虫杆状病毒表达系统。该系统主要包括以下两个组分：(1) 用于插入目的基因的pFastBac载体，在该系列载体中，目的基因的高水平表达由Autographa californica多核多角体病毒(multiple nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV)的多角体启动子(polyhedrin(PH)promoter)驱动。载体多克隆位点的两侧均为Tn7元件，同时还含有一个庆大霉素抗性基因(gentamicin resistance gene)和形成mini Tn7所需的SV40 polyA signal。(2)含杆状病毒穿梭载体bacmid (bMON14272, 136kb)和辅助质粒(helper plasmid，用于表达转座必须的转座蛋白) pMON7124的大肠杆菌DH10Bac宿主菌株。Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统利用遗传转座(genetic transposition)得到重组病毒。DH10Bac宿主包含的bacmid bMON14272含小型F复制子，卡那霉素抗性基因，mini-attTn7位点和lacZα互补因子(可通过蓝白斑筛选)；辅助质粒pMON7124包含四环素抗性和tnsABCD区域，该区域表达转座反应所需的转座蛋白。当pFastBac重组质粒转化进入DH10Bac细胞后，pFastBac载体上的mini-Tn7位点和DH10Bac宿主菌中bacmid上的mini-attTn7位点之间发生转座(transposition)，产生重组bacmid。该转座会导致bacmid上的LacZ基因的破坏，因此可以通过在细菌培养平板上进行蓝白斑筛选来鉴别含有重组bacmid的DH10Bac菌落，从白色菌落的DH10Bac克隆中可分离出含有编码目的基因的重组bacmid DNA，后者进一步感染昆虫细胞后可产生含有重组子的杆状病毒即可启动外源重组蛋白的表达。表达目的蛋白的杆状病毒在被扩增和滴度测定后，高滴度的杆状病毒即可用于感染昆虫细胞以进行大规模的目的蛋白的表达。4. Bac-to-Bac杆状病毒表达系统进行目的蛋白表达的实验步骤(1)把目的基因克隆至pFastBac系列载体产生重组质粒。根据pFastBac系列载体的多克隆位点选做合适的酶切位点，按照读码框插入待表达的目的基因序列。最后通过测序验证插入序列是否正确。(2)转化pFastBac重组质粒到DH10Bac大肠杆菌中，37℃培养48小时。可以选择pFastBac1-EGFP (D2802)作为对照质粒，可以选购DH10Bac甘油菌(D0346)用于制备感受态细胞。转化后利用蓝白斑筛选重组菌株。重组菌株由于转座会导致LacZ基因的破坏而呈现白斑，用于蓝白斑筛选的LB琼脂糖平板应含有50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，40μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG。(3)选做：挑取白斑，重新划线以确认获得的白色克隆是真实的白斑。平板含有50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，40μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG，37℃培养过夜。(4)挑取白斑，培养过夜。须使用含有50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素和10μg/ml四环素的LB培养液。(5)小量抽提试剂盒提取重组bacmid DNA。推荐使用杆状病毒穿梭载体bacmid小量提取试剂盒(D0031)提取重组bacmid DNA。重组Bacmid DNA应该分装冻存于-20℃，因为反复冻融会导致bacmid断裂等从而显著降低其转化效率。如两星期内使用，可保存于4℃。(6) 重组bacmid的PCR鉴定。利用 PCR反应对阳性克隆进行进一步的验证。PCR 反应所用引物为pUC/M13 forward primer (5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3')，和pUC/M13 reverse primer (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')。没有发生转座的bacmid其所扩增所产生的片段长度为350bp，重组bacmid扩增所产生的片段的长度为350bp加上插入片段的长度。(7)重组bacmid转染昆虫细胞。推荐使用生产的昆虫转染试剂LipoInsect? (C0551)，将提取的重组Bacmid转染进入昆虫细胞。建议使用Grace's Insect Cell Culture Medium培养液进行转染，转染时如果使用的昆虫转染试剂LipoInsect?，实验步骤请严格按照其说明书进行。转染后，28℃培养24小时，细胞和细胞核开始变大；转染后24-72小时，细胞慢慢停止生长、脱落，细胞表面长出芽孢状结构；转染后72小时候细胞开始裂解，此时病毒开始释放到培养液中。如果同时转染了pFastBac1-EGFP (D2802)，在转染72小时后可以观察到大部分细胞呈现绿色荧光，转染后96小时几乎所有的细胞都呈现绿色荧光，这样可以作为整个病毒包装体系的阳性对照。(8)收集P1代杆状病毒。转染96小时后，收集培养液上清，500g离心5分钟以沉淀细胞和细胞碎片，取上清即为P1代杆状病毒。此时病毒滴度通常为1X106-1X107pfu/ml。P1代病毒可短期保存于4℃，或分装于含2% FBS的培养液中后在-80℃较长期保存。反复冻融会大大降低病毒活力，其滴度有可能降低10至100倍。(9)P1代杆状病毒的扩增。P1代病毒再次感染昆虫细胞可获得P2代病毒。如果采用悬浮培养的昆虫细胞进行病毒扩增，建议使用10ml培养液并且控制细胞密度为2X106/ml；如果使用6孔板贴壁培养的细胞进行扩增，细胞密度应为2X106/well，MOI (multiplicity of infection)为0.05-0.1(即每100个细胞用5-10pfu的病毒进行感染)。28℃培养48-72小时后，70-80%的细胞死亡时，收集细胞和上清，500g离心5分钟，取上清即为P2代病毒。此时病毒滴度约为1X107-1X108pfu/ml。可收集本步骤离心后的细胞碎片沉淀，加入适量的1X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(P0015A)，裂解后进行SDS-PAGE凝胶电泳及Western blot检测，以分析确定目的蛋白是否已经正常表达。(10)选做：P2代杆状病毒的扩增。如果P2代病毒滴度仍然偏低，可对P2代病毒再次进行扩增，扩增方法同P2代病毒的扩增方法。P2代病毒感染昆虫细胞后最终会获得滴度更高的P3代病毒。(11)病毒感染昆虫细胞进行目的蛋白的大规模表达。可选择Sf9/Sf1/HighFive的任何一种细胞株进行蛋白大规模表达。但如果表达的是分泌蛋白，建议选用HighFive。建议在昆虫细胞的对数生长期进行病毒感染，此时细胞密度在1X106/ml -2X106/ml为佳，MOI可从5-10开始尝试。建议在不同的时间阶段，如感染后24、48、72或96小时收集细胞，裂解细胞，SDS-PAGE并进行Western Blot检测以确定最佳的停止蛋白表达的时间。因为昆虫细胞内有很多蛋白酶，表达时间过长会导致目的蛋白的降解。分泌蛋白的表达高峰通常在感染后30-72小时，而非分泌蛋白的表达高峰通常在感染后48-96小时。5. 目的蛋白的纯化利用pFastBac1进行目的蛋白的表达的时候，根据蛋白纯化方式的需要以及融合表达目的蛋白以提高其表达量的需要，可以在质粒构建时添加His标签或GST标签。为了防止额外添加的His和GST等蛋白标签影响目的蛋白的生物学功能和结构研究，可在融合蛋白和标签之间添加蛋白酶酶切位点，如TEV或PreScission的酶切位点。昆虫表达蛋白的纯化步骤和大肠杆菌表达蛋白的纯化步骤基本一致。如果蛋白主要以可溶形式表达，离心收集昆虫细胞，超声裂解细胞，但由于昆虫细胞内蛋白酶种类比较多，需要添加各种蛋白酶抑制剂。离心收集超声后上清，使用镍柱或GST柱等纯化目的蛋白。推荐使用BeyoGold? His-tag Purification Resin (P2210/P2218/P2220)进行His标签蛋白的纯化，推荐使用BeyoGold? GST-tag Purification Resin(P2250/P2251/P2253/P2255) 进行GST标签蛋白的纯化，同时可以利用离子交换、分子筛层析等进一步纯化目的蛋白。可以使用PreScission Protease (P2302/P2303)或者TEV Protease (P2307/P2308)进行柱上酶切或者洗脱后酶切(如果使用TEV Protease，我们推荐使用洗脱后酶切)以取代蛋白标签。纯化获得的蛋白，可以添加适量甘油后保存，或者如果有需要也可以适当浓缩后保存等。?。

　　昆虫细胞是主要提取来自昆虫的一类真核细胞。通过培养制造宿主的病毒，可以引起昆虫流行病，但对人畜和植物无害，因而可作病毒杀虫剂，还可以生产某些药用蛋白。细胞培养瓶是培养昆虫细胞常用的一种细胞培养耗材，那么在培养昆虫细胞时需要注意哪些问题呢？　　1、温度与环境：昆虫细胞一般应该在27℃、非湿化的环境中培养，建议不要进行二氧化碳交换，所以细胞培养瓶尽量选择密闭的盖子。　　2、培养基：不同细胞对培养基的需求也有所差异，应该根据细胞生长特性，选择昆虫细胞专用的培养基。　　3、贴壁昆虫细胞：细胞密度低于汇合状态的20% 时，细胞生长会受到抑制。健康状态的细胞是对数期收获的细胞，所以在传代时应选择对数期进行。但是，如果培养的是强贴壁性昆虫细胞，则应在细胞达到汇合状态或者刚刚开始从培养瓶底部脱离时进行传代，因为此时细胞容易脱离。　　4、贴壁昆虫细胞在无血清培养条件下，昆虫细胞与基质贴附非常牢固，需要花费较大力气才能使其脱落。要使细胞脱落，可以采用拍掌的动作快速振摇一下细胞培养瓶。为了避免污染，进行此操作前必须盖紧盖子。　　5、悬浮培养：一些昆虫细胞系可能需要一定的过程来适应悬浮培养。进行细胞悬浮培养时无需更换培养基，定期传代时需要吸出细胞悬液，然后加入适量培养基，将细胞稀释到适当的密度。添加新鲜培养基后可使细胞营养素达到完全补充。　　以上是细胞培养瓶培养昆虫细胞需要注意的五个方面，此外还要注意尽量不要剧烈摇晃细胞培养瓶，避免对细胞造成损伤。

　　2023年端午节时间为6月22日，星期四，根据《国务院办公厅公布2023年放假安排》2023年端午放假通知如下：2023年6月22日星期四端午节当天放假1天，与周六连休，6月25号星期日正式上班。　　节假日期间我司不安排人员值班，如有产品咨询以及技术问题留言到我司网站，我们会在节假日为您报价处理，感谢您对上海远慕生物的信赖和支持！在此我司全体员工提前祝各位科研人员以及新老客户节日快乐！　　2023.6.21    远慕生物特此通知。

酶抑制剂是指特异性作用于酶的某些基团，降低酶的活性甚至使酶wan全丧失活性的物质。是很多外来化合物产生毒作用的机理。可分为：①不可逆性抑制，抑制剂与酶活性中心的必需基团结合，这种结合不能用稀释或透析等简单的方法来解除。如有机磷农药与胆jian碱酶活性中心的丝an酸羟基结合，一些重金属离子与多种酶活性中心半胱an酸残基的－SH结合。②可逆性抑制，有竞争性和非竞争性两种，竞争性抑制是抑制剂和底物争相与酶结合，增加底物浓度可使抑制减弱，如丙二酸抑制琥珀酸脱氢酶；非竞争性抑制可以降低酶的活性，如qing化物能与细胞色素氧化酶的Fe3+结合成氰化高铁细胞色素氧化酶，使之丧失传递电子的能力，引起内窒息。

含量测定的定量分析法大类上主要包括：色谱分析法,光谱分析法，定量分析法。一、色谱分析法色谱分析法是一种分离分析方法，系根据混合物中各组分的色谱行为差异，将组分从混合物中分离后再选择性对待测组分进行分析的方法。因此色谱分析法是分析混合物的最有力的手段。1. 高效液相色谱法（HPLC） HPLC全称是High Performance Liquid Chromatography（高效液相色谱法），又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。HPLC检测方法，因对含有众多成分的复杂体系具有强大的分离功能，且分析速度快，其重现性和准确度优于薄层色谱法。是中药及其制剂含量测定的首选方法，中国药典大多采用 HPLC 进行含量测定。 1.1 高效液相色谱分析的流程由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。    1.2 高效液相色谱的分离过程同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C 在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。1.3 高效液相色谱含量计算一般分面积归一法，外标法，内标法，植物提取物用前两个比较多。面积归一化法：假定样品中的所有组分全部流出而且检测器对它们都产生信号，计算各杂质峰面积以及总和。该方法操作简单，不用标准品，结果相对准确，但是校正因子确定繁琐和重复性不好。国内植物提取物厂家很多为用的是这种检测方法。外标法：要用标准品，检测结果准确，但是受标准物质和线性范围影响。标准品分国产和进口的，有时客户会指定进口的标品，价格比较昂贵。内标法： 色谱分析中一种比较准确的定量方法，尤其在没有标准物对照时，此方法更显其优越性。内标法是将一定重量的纯物质作为内标物(参见内标物条)加到一定量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积(或峰高)及相对校正因子，按公式和方法即可求出被测组分在样品中的百分含量。检测结果很准确但是内标物选择困难。植物提取物一般不用。2. 薄层色谱分析法（TLC）薄层色谱分析法是将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，根据比移值(Rf)与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值(Rf)作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，属于固－液吸附色谱。它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至0.01μg）的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。此外，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。3. 气相色谱法（GC）GC：Gas Chromatography 气相色谱法用气体作为移动相的色谱法。用气体为流动相流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法，一般用于测挥发物质的含量，比如农药残留 666，DDT 的检测用的就是这种方法。根据所用固定相的不同可分为两类：固定相是固体的，称为气固色谱法；固定相是液体的则称为气液色谱法。气相色谱系统由盛在管柱内的吸附剂，或惰性固体上涂着液体的固定相和不断通过管柱的气体的流动相组成。将欲分离、分析的样品从管柱一端加入后，由于固定相对样品中各组分吸附或溶解能力不同，即各组分在固定相和流动相之间的分配系数有差别，当组分在两相中反复多次进行分配并随移动相向前移动时，各组分沿管柱运动的速度就不同，分配系数小的组分被固定相滞留的时间短，能较快地从色谱柱末端流出。以各组分从柱末端流出的浓度 c对进样后的时间t作图，得到的图称为色谱图。二、光谱分析法当物质吸收辐射能或者热能后，其内部发生能级跃迁，记录由能级跃迁所产生的辐射能随波长的变化所得到的图谱成为光谱。利用物质光谱进行定性，定量和结构分析的方法称为光谱分析法。1. 紫外吸收光谱分析法（UV）UV检测法也是植物提取物常用的检测方法之一，UV全称紫外-可见分光光度法，是 Ultraviolet and visiblespectrophotometry 的缩写，是基于物质分子对紫外光区(波长200~400nm)和可见光区(波长为 400~760nm)的单色光辐射的吸收特性建立的色谱分析方法。UV检测也称紫外检测法、紫外光谱检测法。 UV检测法主要用于配合物组成及其稳定常数的测定。紫外光谱是分子中某些价电子吸收了一定波长的电磁波,由低能级跃近到高能级而产生的一种光谱，当分子中的电子吸收能量后会从基态跃迁到激发态，然后放出能量（辐射出特征谱线），回到基态；而辐射出特征普线的波长在紫外区中就叫做紫外光谱（UV）。1.1 UV定性分析在有机化合物的定性分析中，紫外－可见光谱适用于不饱和有机化合物，尤其是共轭体系的鉴定，以此推断未知物的骨架结构。此外，可配合红外光谱、核磁共振波谱法和质谱法进行定性鉴定和结构分析，因此它仍不失为是一种有用的辅助方法。一般有两种定性分析方法，比较吸收光谱曲线和用经验规则计算最大吸收波长λmax，然后与实测值进行比较。 结构分析可用来确定化合物的构型和构象。如辨别顺反异构体和互变异构体。1.2 UV定量分析紫外－可见分光光度定量分析的依据是Lambert-Beer定律，即在一定波长处被测定物质的吸光度与它的溶度呈线性关系。应此，通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度可求出该物质在溶液中的浓度和含量。常用的测定方法有：单组分定量法、多组分定量法、双波长法、示差分光光度法和导数光谱法等。1. 原子吸收光谱法（AAS）原子吸收光谱法（AAS），全称是Atomic Absorption Spectrometry。是基于气态的基态原子外层电子对紫外光和可见光范围的相对应原子共振辐射线的吸收强度来定量被测元素含量为基础的分析方法，是一种测量特定气态原子对光辐射的吸收的方法。AAS基本原理是，每一种元素的原子不仅可以发射一系列特征谱线，也可以吸收与发射线波长相同的特征谱线。当光源发射的某一特征波长的光通过原子蒸气时，即入射辐射的频率等于原子中的电子由基态跃迁到较高能态（一般情况下都是第一激发态）所需要的能量频率时，原子中的外层电子将选择性地吸收其同种元素所发射的特征谱线，使入射光减弱。由于原子能级是量子化的，因此，在所有的情况下，原子对辐射的吸收都是有选择性的。由于各元素的原子结构和外层电子的排布不同，元素从基态跃迁至第一激发态时吸收的能量不同，因而各元素的共振吸收线具有不同的特征。原子吸收光谱位于光谱的紫外区和可见区。三、定量分析法定量分析法也称滴定法，是将已知浓度的滴定液(标准物质溶液)由滴定管滴加到被测溶液中，直至滴定液与被测物质反应完全(通过适当方法指示)，然后根据滴定液的浓度和被消耗的体积，按化学计量关系计算出被测物质的含量。四：目前植物提取物常见五种检测方法的应用领域检测方法应用领域高效液相色谱法（HPLC）标准植物提取物的常用检测方法薄层色谱分析法（TLC）被用于比例提取物的检测气相色谱法（GC）用来检测挥发性液体或油类紫外分光光度计（UV）标准植物提取物的常用检测方法原子吸收光谱法（AAS）用于提取物重金属含量的检测

细胞裂解液各成分的作用：1、第一种50mmol/L Tris-HCl是缓冲液，保证细胞裂解时PH值也能稳定，Tris是一种有机碱。2、第二种1.0 mmol/L EDTA是一种金属螯合剂。3、第三种150 mmol/L NaCl是等渗体系电解质，用于协调细胞膜内外离子平衡。4、第四种0.1% SDS是十二烷基硫酸钠，是一种表面活性剂和还原剂，有增溶作用。制备细胞裂解液实验流程：1. 收集胰蛋白酶消化的细胞并离心，用PBS清洗。2. 用100μl 裂解缓冲液冰浴溶解沉淀10min（每500000个细胞20μl裂解缓冲液）。3. 10000rpm，4°C离心10min，取上清转移至新管。4. 用考马斯亮蓝法检测蛋白质浓度。5. 用裂解缓冲液将溶液浓度调到5mg/ml，每小瓶中放100μl，-80°C储存。6. 按照1：1体积比混合2×样品缓冲液，煮沸5min后，室温放置5min。7. 短时离心后点样电泳检测。溶液准备：裂解缓冲液：0.15M NaCl, 5mM EDTA(pH 8.0), 1% Triton×100, 10mM Tris-Cl(pH 7.4); 使用前加 5mM DTT, 0.1mM PMSF 异丙醇和5mM ε-氨基己酸2×样品缓冲液：130mM Tris-HCl（pH8.0）, 20%（v/v）甘油, 4.6%（w/v）SDS, 0.02%溴酚蓝, 2%DTTPBS（pH7.4）：10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, 50mM NaCl, 2.7mM KCl 

  动物细胞融合也称细胞杂交（cell hybridization），是指两个或多个动物细胞融合成一个细胞的过程，融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。  诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（离心，震动，电刺激）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。  细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。 而动物细胞融合技术最重要的用途是制备单克隆抗体。  原理：细胞膜具有一定的流动性  促进动物细胞融合的诱导剂  动物：物理法、化学法（同植物）以及生物法（灭活病毒等）；  植物：物理法（离心、振动、电刺激等）和化学法（聚乙二醇（PEG））。  动物细胞融合也称细胞杂交（cellhybridization），是指在一定的条件下将两个或多个动物细胞融合为一个细胞的过程，融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞（hybridcell）。  诱导动物细胞融合的意义：突破了有性杂交方法的局限，克服了远缘杂交的不亲和性，使远缘杂交成为可能，为制造单克隆抗体提供了条件。成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。

一、细胞融合的方法有三种：生物方法、化学方法、物理方法。二、细胞融合也称细胞杂交,是指细胞通过介导和培养,在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合(合并)成一个核或多核的杂合细胞的过程。体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。三、化学诱导融合1.盐类融合法。此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。2.高钙和高pH值融合法。高Ca2+和高pH值可以诱发融合。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。3、聚乙二醇融合法(PEG法)。1974年发现的聚乙二醇(PEG)使不同科属的植物原生质体之间都可以融合，融合率可达30%。聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。PEG可与水分子借氢键结合，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，从而引起细胞融合。为了发挥PEG促进细胞融合的效力，必须采用较高的浓度(40%～50%，分子量为6000)，但PEG在高浓度下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。影响原生质体融合的因素很多。特别是环境中的阳离子存在，融合时的pH?也对原生质体融合有较明显的影响。一般来讲钙、镁离子有助于融合。如有钙离子存在时，可得到较高的融合率。但在缺乏钙离子时，若pH?较低，融合频率也较高。这是因为钙离子和带负电荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用，使原生质体带电，彼此易于附着发生凝集所致。PEG诱导细胞融合由于具有容易制备和控制、活性稳定、使用方便等特点，在细胞融合领域取得了可喜的成绩，大量的研究仍采用此法。虽然PEG作为融合剂有很多成功的报道，但存在着对细胞损伤大、残存有毒性、融合率较底及经验性大等缺陷。四、物理诱导融合1.细胞电融合技术细胞电融合是以脂质膜和脂质一蛋白质膜的电学性质为基础的，以双向电泳和电子击穿细胞质膜的联合作用为手段，和细胞电注射构成一对互补技术。在短时间强电场的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿(Reverisb?leb?reakdown)，瞬时失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟后恢复原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时，即可诱导他们的膜相互融合，从而导致细胞融合。细胞融合分为两步：第一步是建立细胞间接触(cell-to-cell?contact)?；?第二步，接受区膜结构受扰动而紊乱，然后恢复并融合。根据其诱导细胞接触的性质，分为特异性和非特异性两大类。非特异性细胞电融合法是指在进行细胞电融合时，无法排除亲本细胞的自体融合而只进行双亲本间的细胞杂交融合。主要原因是细胞间的相互接触是无选择性的，是非特异性细胞聚集。非特异性电融合技术包括细胞物理聚集电融合法和细胞化学聚集电融合法。细胞融合所必需的两个步骤为：①细胞间接触；②接触区的膜结构受到瞬间扰动而导致融合。只要其中的任意一步有特异性，就能形成特异性的细胞融合。?2.激光诱导法。激光诱导细胞融合术是利用激光微束对相邻细胞接触区的细胞膜进行破坏(或扰动)，可将两个不同特性、不同大小的细胞在显微镜下实现融合。即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并紧密接触，然后对接触处进行脉冲激光束处理，使质膜发生光击穿，产生微米级的微孔。这样，由于质膜上微孔的可逆性，细胞开始变形融合，最终成为一个细胞。使用此技术时，使细胞接触的方法可用①光俘虏法；②用低浓度的融合剂PEG?(5%?)使细胞聚法。目前，最新颖的方法是利用激光光阱建立两细胞间接触，即光镊利用激光高斯光束光场的梯度力把细胞从光束边缘拉向光束中间，在光斑直径与光波波长尺度相比拟时，指向束腰的轴向梯度力要大于沿光束方向的散射力，该梯度力把细胞竖直地拉到激光束腰下方处，从而实现对细胞的操作。细胞融合实验的注意事项1、整个制备过程需严格无菌及温度控制。2、细胞传代培养时注意适时更换培养液。3、SP2/0细胞与脾细胞比例需严格控制，这决定了融合率。4、融合细胞因细胞膜受损而特别脆弱，操作过程需温和小心。5、融合剂PEG的加入时间需准确把握，避免融合失败。

1. 细胞株取材要求新鲜，无菌，解剖小鼠时，注意不要损伤脾脏及其周围的脏器，尤其是肠道等，防止污染脾脏。2. 冲洗脾脏时要尽量洗净血污，去除无用组织，并要防止组织干燥。3. 碾磨后及时用清水冲洗筛网，防止组织、细胞阻塞网孔。4. 计数前，注意吸尽平皿里的细胞，充分混匀，使细胞分散成单个细胞。5. 实验操作应在操作台*无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。6. 金属器械不能在火焰中烧的时间过长，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。7. 另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。8. 吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。9. 不能用手触及已消毒器皿瓶口、瓶塞内部，吸管前部等所有可能与细胞接触的部分，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。10. 开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。细胞株防止因温度过高烧死细胞。11. 换液时倾倒废液，瓶口不能接触废液缸，速度不能过快，防止废液四溅。12. 吹打细胞时，要注意边角的细胞是否吹打下来。13. 手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上，即不可以在开放容器上方操作。14. 每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。15. 注意自身的安全，对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂例如DMSO，并避免尖锐物品伤人等。16. 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但为对数生长期细胞。在冻存前一天换一次培养液。17. 将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤。18. 细胞株冻存和复苏用新配制的培养液。

1.动物细胞培养在所有的细胞离体培养中，困难的是动物细胞培养。下面是它所需要的特殊条件。⑴血清:动物细胞离体培养常常需要血清。常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。有一天人们真正学会了配制和血清一样的培养液，那时血清才可被取代。在这里，血清等于是动物细胞离体培养的天然营养液。⑵支持物:大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃，高速冷冻离心机，塑料等作为支持物。⑶气体交换:二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件，每一次开箱操作后的快速恢复对设备的要求可想而知有多难?由此决定了动物细胞离体培养设备要求高、投资大。2.植物细胞培养⑴光照:离体培养的植物细胞对光照条件不甚严格，因为细胞生长所需要的物质主要是靠培养基供给的。但光照不但与光合作用有关，而且与细胞分化有关，例如光周期可对性细胞分化和开花调控作用，所以以获得植株为目的的早期植物细胞培养过程中，光照条件特别重要。以植物细胞离体培养方式获得重要物质，如药物的过程，植物细胞大多是在反应器中悬浮培养。⑵激素:植物细胞的分裂和生长特别需要植物激素的调节，促进生长的生长素和促进细胞分裂的分裂素是基本的激素。植物细胞的分裂，生长，分化和个体生长周期都有相应的激素参与调节。和动物细胞相比，植物细胞离体培养对激素要求的原理已经了解，其应用技术也已相当成熟，已经有一套广泛作为商品使用的培养液。同时解决了植物细胞对水、营养物、激素、渗透压、酸碱度、微量元素等的需求。3.微生物细胞培养微生物多为单细胞生物，野生生存条件比较简单。所以微生物人工培养的条件比动植物细胞简单得多。其中厌氧微生物培养比好氧微生物复杂，因为严格厌氧需要维持二氧化碳等非氧的惰性气体浓度，而好氧微生物则只需要通过不断搅拌提供无菌氧气。微生物对培养条件要求不如动植物细胞那样苛刻，玉米浆、蛋白胨、麦芽汁、酵母膏等成为良好的微生物天然培养基。对于一些特殊微生物的营养条件要求，可以在这些天然培养基的基础上额外添加。

大家在养细胞的时候，想必大家也一定遇到过细胞状态差这种情况，但是细胞状态差，有很多种原因造成。细胞状态很差，常常出现的现象是：细胞边缘不清晰、细胞不饱满、折光性差、背景比较脏、黑点很多、细胞碎片多（细胞凋亡后的细胞碎片）、单个细胞内有空泡（凋亡）且空泡比较多；如果细胞出现老化，也就是细胞比较扁平、增殖减缓、细胞核体积增大、细胞突触变多，此时观察到的细胞状态也是不正常的。所以，除了考虑血清和细菌污染的问题，细胞老化也不容忽视~何为细胞老化？1882年，德国生物学家Weismann曾大胆预测“在细胞水平存在老化现象”。他推测：机体的寿命限制受控于体细胞的分裂能力；在遗传进化中，不同物种的体细胞获得了不同分裂的潜能，从而决定了不同物种的寿命长短。20世纪50年代，Swin和他的同事利用原代细胞体外培养试验证明了来源于不同物种的纤维细胞均不具备无限分裂的潜能。取得突破性进展的还是Hayflflick和Moorhead，他们做了更系统更细致的观察和描述，他们对25株人成纤维细胞进行原代培养，在这个过程中发现，经过约50次传代之后，所有细胞出现功能退化，并且丧失分裂能力的现象。此后人们将这一现象称之为“Hayflflick极限”或者自发性老化。之后也有事实证明，细胞老化并不是体外培养所导致，细胞在体内也会随着年龄的增长，逐步走向老化。细胞老化的征兆细胞周期阻滞长期的细胞周期阻滞是老化细胞的基本特征，也是体外鉴定细胞老化不可或缺的指标。为了检查细胞是否跃出了细胞周期，人们通常检测增殖指示分子Ki-67的表达丰度；或者通过将与胸腺嘧啶相似的溴脱氧尿嘧啶（Bromodeoxyuridine，BrdU）掺入到细胞培养基中，观察是否有新的DNA合成。细胞老化主要表现为G1期阻滞，个别情况下也可伴随G2/M期周期阻滞，或直接由G2/M期阻滞诱发形成。细胞形态改变虽然由于细胞周期的中断和DNA复制的停止，老化细胞内的DNA含量与正常细胞类似，但 RNA与蛋白质丰度均比正常细胞要明显升高。这是因为，尽管细胞进入老化阶段后蛋白质的整体合成速率降低，但是蛋白质的降解体系受到更加明显的抑制，导致蛋白质在细胞内持续堆积。但，由于不同组织来源的细胞，其形态本就各不相同，因此，目前还并无客观的、统一的标准从细胞形态判断并定义老化细胞。换句话说，目前并不能直接根据细胞的形态去判断是否老化细胞。无论是原代细胞或是细胞株，在细胞培养过程中细胞老化现象是存在且常见的，但却容易被操作人员忽略，老化的细胞会出现的特征包括：细胞增殖变慢、细胞核体积异常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、细胞体积增大、细胞扁平、细胞质中出现空泡等现象。总结研究表明,衰老细胞的细胞核、细胞质和细胞膜等均有明显的变化：①细胞内水分减少,体积变小,新陈代谢速度减慢；②细胞内酶的活性降低；③细胞内的色素会积累；④细胞内呼吸速度减慢,细胞核体积增大,核膜内折,染色质收缩,颜色加深.线粒体数量减少,体积增大；⑤细胞膜通透性功能改变,使物质运输功能降低.形态变化总体来说老化细胞的各种结构呈退行性变化.衰老细胞的形态变化表现有：1、核：增大、染色深、核内有包含物 2、染色质：凝聚、固缩、碎裂、溶解 3、质膜：粘度增加、流动性降低 4、细胞质：色素积聚、空泡形成 5、线粒体：数目减少、体积增大 6、高尔基体：碎裂 7、尼氏体：消失 8、包含物：糖原减少、脂肪积聚 9、核膜：内陷分子水平的变化1、DNA：从总体上DNA复制与转录在细胞衰老时均受抑制,但也有个别基因会异常激活,端粒DNA丢失,线粒体DNA特异性缺失,DNA氧化、断裂、缺失和交联,甲基化程度降低.2、 RNA：mRNA和tRNA含量降低.3、蛋白质：含成下降,细胞内蛋白质发生糖基化、氨甲酰化、脱氨基等修饰反应,导致蛋白质稳定性、抗原性,可消化性下降,自由基使蛋白质肽断裂,交联而变性.氨基酸由左旋变为右旋.4、 酶分子：活性中心被氧化,金属离子Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+等丢失,酶分子的二级结构,溶解度,等电点发生改变,总的效应是酶失活.5、脂类：不饱和脂肪酸被氧化,引起膜脂之间或与脂蛋白之间交联,膜的流动性降低。那我们该如何防止细胞老化？1. 不要等细胞长得太满才传代。细胞太密会导致细胞状态下降，产生细胞接触性抑制。2. 细胞不要消化过度。采用胰蛋白酶消化细胞，会造成细胞表面一定程度的细胞损伤。3. 最重要的是使用优质的血清和培养基：干细胞对培养基中的内毒素非常敏感。除了要留意基础培养基的内毒素外，也要留意血清的内毒素。如果血清中内毒素≥3EU/ml时，干细胞很容易老化或死亡，导致细胞“亚健康”状态，导致实验受到影响。很多使用者，在血清在试用前，就会通过提早审核该批次《检测报告》，以决定是否入围进行试用。4. 在开始养细胞并传代时，也要特别注意冻存细胞，以保持细胞有种子库存在，可以有效避免细胞损伤。

在细胞培养中大多数动物细胞体外培养时都需要加入血清提供营养，但由于血清存在很多潜在风险，促使科学家们进行无血清驯化细胞的研究。所以，在1976 年Hayashi 等人提出了无血清培养基的概念，此后，大量生物医药学家开始对无血清培养基进行研制。80 年代后，无血清培养基的研究与制备广泛发展，到 90 年代已有一些商业化无血清培养基。与传统的培养基相比较，无血清培养基是不含动物血清，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、增殖的一种培养基。无血清培养基由于其组成成分相对清楚，制备过程简单，在现代生物技术学领域得到广泛应用。无血清培养基的组成和作用1.葡萄糖动物细胞培养基中添加的糖主要是葡萄糖，添加量通常在5-25mM之间。葡萄糖的主要代谢途径是通过糖酵解代谢成丙酮酸，进而降解成乳酸。这最终会导致乳酸在培养基中积累。代谢流研究分析发现，只有一小部分（约20-30%）的葡萄糖流向其它途径包括三羧酸循环和戊糖磷酸旁路。除了葡萄糖，研究发现，动物细胞也能利用谷氨酰胺作为主要的能量物质。谷氨酰胺的添加量常常高于其它氨基酸（2-4mM），也是很多细胞系生长需要的物质。在大多数情况下，谷氨酰胺和葡萄糖会分别被快速利用，在耗尽之前，会引起细胞生长抑制。2.氨基酸细胞不同，所需的特定营养也不同，同理，它们所需的必需氨基酸（动物体内不能自身合成）也是不同的。一些非必需氨基酸通常也会加入到培养基中，这是因为有些细胞系自身不能产生相应的氨基酸，从而会限制细胞生长。培养基中氨基酸限制会降低细胞生长速率和/或最高细胞密度。其它非必需氨基酸细胞可以产生，但是不足以维持最优生长。一些氨基酸如谷氨酰胺在培养基中不稳定，因此需要单独加入以维持其在一个合适的浓度水平。支链氨基酸被很多细胞包括MDCK细胞、人成纤维细胞、小鼠骨髓瘤细胞和BHK细胞等消耗得特别快。研究发现，当杂交瘤细胞利用谷氨酰胺利用率很低的时候，支链氨基酸被氧化的更多。同样，谷氨酰胺的消耗降低，丝氨酸的消耗就会升高。一些细胞系对氨基酸限制比其它细胞要敏感，因此，在大规模培养基中，补料策略非常重要。例如，谷氨酰胺浓度低，BHK细胞就会消耗更多的其它氨基酸，尤其是必需氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸和非必需氨基酸如丝氨酸和谷氨酸盐。3.盐为防止渗透压失衡，培养基的盐浓度需与渗透压匹配。培养基细胞生长标准渗透压是300mOsm/kg，这个渗透压适用于绝大多数细胞。值得注意的是，由于盐会改变培养基的渗透压，因此，向培养基中加盐的时候要特别小心。大多数细胞能承受的渗透压范围在270~330mOsm/kg。经常用的盐有Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO42-、PO43-和HCO3-。它们几乎出现在所有的基础培养基中。4.微量元素培养基中添加了血清含有的无机微量元素，如Mn、Cu、Zn、Mo、Va、Se、Fe、Ca、Mg、Si、Ni和不常用的微量元素如Al、Ag、Ba、Br、Cd、Co、Cr、F、Ge、J、Rb和zr。这些微量元素激活酶的活性，也是大多数细胞生长所需的元素。无血清培养基中经常添加的元素是硒。硒的主要功能是抗氧化和促进细胞生长，硒以硒蛋白家族形式在动物细胞中发挥生理作用，目前已被确认的形式有11种，据研究，这些蛋白均参与抗氧化活动，如谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白酶。在某些情况下，特定微量元素的加入会降低对某种生长因子的需求。例如，在很多细胞如B淋巴细胞、MDCK和人二倍体成纤维细胞中，亚铁盐能够替代转铁蛋白。研究发现，钙参与细胞增殖活动，这对于很多过程如信号转导、细胞分裂和细胞黏附等过程很重要。钙调蛋白（一种钙激活蛋白）通过不同的浓度水平调节细胞分裂过程中的很多丝氨酸/苏氨酸激酶活性。钙浓度升高，对很多细胞如角质形成细胞和人二倍体成纤维细胞生长有利。降低培养基中的钙浓度，就会降低细胞间的黏附。在很多生产系统中，细胞结团是一个大问题，这会降低产量和细胞存活率。如降低培养基中的钙浓度，则可以避开这个问题的产生，而且这在很多搅拌培养系统中被证明十分有效。5.维生素培养基中的维生素和荷尔蒙浓度相对较低，它们被作为辅助因子利用，不同细胞系对它们的营养需求存在很大不同。因此，这些辅助因子在不同的培养基中变化很大。维生素对细胞的限制表现在细胞生长和存活上，但不影响最高细胞密度。培养基中的维生素水平随细胞种类的不同而不同。基础培养基配方如为HeLa细胞和小鼠成纤维细胞而设计的BME培养基含有生物素、叶酸、尼可酰胺、泛酸盐、吡哆醛、核黄素和硫胺。无血清培养基配方越复杂，例如F12、DMEM、M199，它含有的维生素种类就越多。每种维生素的含量都是根据具体的细胞系靠经验添加。因此，每种培养基都需要根据不同的情况而设计。6.缓冲盐在细胞培养过程中，HCO3-经常和二氧化碳环境（5-10%）配合使用作缓冲系统，这使得培养基的pH普遍维持在6.9-7.4，在培养箱或者摇瓶中，通过控制气体控制CO2，HCO3--CO2缓冲系统的缺点在于，离开CO2的环境，培养基迅速变为碱性。为防止这种情况发生，有机缓冲液Hepes（pH7.0）经常以~25mM的浓度加入培养基，这使得CO2的浓度可以降低至2%7.生长因子为促进细胞生长，经常在一些培养基中添加特定蛋白，在无血清或低血清的培养基中，这些蛋白能够为细胞生长提供基础物质。他们被称为“生长因子”。这类生长因子包括成纤维细胞生长因子（酸性FGF和碱性FGF）、类胰岛素生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）、神经生长因子（NGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）和转化生长因子（TGF：α和β）。这些生长因子在1-10ng/mL的范围内均有活性。8.脂类在细胞内，脂类有很多作用。它们是细胞膜、外部信号传感器的组件，也是能量代谢之源。血清本身含有脂类，但是基础培养基配方通常不含脂类。某些脂类作为添加剂添加到无血清培养基中，显示有促进细胞增殖的作用。通常，血清中的脂类有脂肪酸、磷脂、卵磷脂和胆固醇。磷脂不但是细胞膜的主要构成组件，在调节生长的信号传导途径中也起到非常重要的作用。在细胞外，磷脂对很多细胞系的生长起促进作用。在很多贴壁细胞如MDCK、小鼠上皮细胞和其它肾细胞中，磷脂酸和溶血磷脂酸能促进它们生长。在无血清培养基中，其它脂类如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇可以促进人二倍体成纤维细胞的生长。胆固醇对大多数细胞也有促进生长作用，也是某些细胞（如骨髓瘤细胞）生长的必需成分。其它一些特定的脂肪酸，如油酸和亚油酸，在杂交瘤细胞的无血清培养的传代中也能提高生长速度和产量。无血清培养基的优势1.可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。2.避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。3.避免血清组分对实验研究的影响。4.有利于体外培养细胞的分化。5.可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。无血清培养基的缺点1.细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。2.成本较高。3.针对性很强，一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养。

一、指示剂分类：1、酸碱指示剂。指示溶液中H+浓度的变化，是一种有机弱酸或有机弱碱，其酸性和碱性具有不同的颜色。指示剂酸HIn在溶液中的离解常数Ka=[H+][In-]/[HIn]，即溶液的颜色决定于[In-]/[HIn]，而[In-]/[HIn]又决定于[H+]。以甲基橙(Ka=10-3.4)为例，溶液的pH4.4时，呈碱性，具黄色;而在pH3.1~4.4，则出现红黄的混合色橙色，称之为指示剂的变色范围。不同的酸碱指示剂有不同的变色范围。2、金属指示剂。络合滴定法所用的指示剂，大多是染料，它在一定pH下能与金属离子络合呈现一种与游离指示剂完全不同的颜色而指示终点。3、氧化还原指示剂。为氧化剂或还原剂，它的氧化形与还原形具有不同的颜色，在滴定中被氧化(或还原)时，即变色，指示出溶液电位的变化。4、沉淀滴定指示剂。主要是Ag+与卤素离子的滴定，以铬酸钾、铁铵矾或荧光黄作指示剂。在实际工作中，肉眼是难以准确地观察出指示剂变色点颜色的微小的改变。人们目测酸碱指示剂从一种颜色变为另一种颜色的过程，只能在一定的pH变化范围内才能发生，即只有当一种颜色相当于另一种颜色浓度的十倍时才能勉强辨认其颜色的变化。在这种颜色变化的同时，介质氢灭菌生物指示剂的pH值则由一个值变到另一个值。当溶液的pH值大于pKHIn时, [In-]将大于[HIn]且当[In-]/[HIn]=10时，溶液将完全呈现碱色成分的颜色，而酸色被遮盖了，这时溶液的 pH=pKHIn + 1。同理，当溶液的pH值小于pKHIn时, [In-]将小于[HIn]且当[In-]/[HIn]=1/10时，溶液将完全呈现酸色成分的颜色，而碱色被遮盖了，这时溶液的 pH=pKHIn - 1。可见溶液的颜色是在从pH=pKHIn - 1到 pH=pKHIn + 1的范围内变化的，这个范围称为指示剂的变色范围即变色域。在变色范围内，当溶液的pH值改变时，碱色成分和酸色成分的比值随之改变，指示剂的颜色也发生改变。超出这个范围，如pH≥pKHIn + 1时，看到的只是碱色;而在pH≤pKHIn - 1时，则看到的只是酸色。因此指示剂的变色范围约2个pH单位。由于人的视觉对各种颜色的敏感程度不同，加上在变色域内指示剂呈现混合色，两种颜色互相影响观察，所以实际观察结果与理论值有差别，大多数指示剂的变色范围小于2个PH单位。二、指示剂用量问题双色指示剂的变色范围不受其用量的影响，但因指示剂本身就是酸或碱，指示剂的变色要消耗一定的滴定剂，从而增大测定的误差。对于单色指示剂而言，用量过多，会使用变色范围向pH值减小的方向发生移动，也会增大滴定的误差。例如:用0.1mol/LnaOH滴定0.1mol/LHAc,pHsp=8.5,突跃范围为pH8.70-9.00,滴定体积若为50ml,滴入2-3滴酚酞，大约在pH=9时出现红色;若滴入10-15滴酚酞，则在pH=8时出现红色。显然后者的滴定误差要大得多。指示剂用量过多，还会影响变色的敏锐性。例如：以甲基橙为指示剂，用HCl滴定NaOH溶液，终点为橙色，若甲基橙用量过多则终点敏锐性就较差。三、常用指示剂的配制二苯胺磺酸钠指示液取二苯胺磺酸钠0.2g，加水100ml使溶解，即得。二苯偕肼指示液 取二苯偕肼1g，加乙醇100ml使溶解，即得。双硫腙指示液 取双硫腙50mg，加乙醇100ml使溶解，即得。石蕊指示液 取石蕊粉末10g,加乙醇40ml，回流煮沸1小时,静置，倾去上层清液，再用同一方法处理二次，每次用乙醇30ml，残渣用水10ml洗涤，倾去洗液，再加水50ml，煮沸，放冷，滤过，即得。变色范围 pH4.5~8.0(红→蓝)。甲酚红指示液 取甲酚红0.1g，加0.05mol/L氢氧化钠溶液5.3ml使溶解，再加水稀释至100ml，即得。变色范围 pH7.2~8.8(黄→红)甲酚红-麝香草酚蓝混合指示液取甲酚红指示液1份与0.1%麝香草酚蓝溶液3份,混合，即得。甲基红指示液取甲基红0.1g，加0.05mol/L氢氧化钠溶液7.4ml使溶解，再加水稀释至200ml，即得。变色范围 pH4.2~6.3(红→黄)。甲基红-亚甲蓝混合指示液取0.1%甲基红的乙醇溶液20ml，加0.2%亚甲蓝溶液8ml，摇匀，即得。甲基红-溴甲酚绿混合指示液取0.1%甲基红的乙醇溶液20ml，加0.2%溴甲酚绿的乙醇溶液30ml，摇匀，即得。甲基橙指示液取甲基橙0.1g，加水100ml使溶解，即得。 变色范围 pH3.2~4.4(红→黄)。甲基橙-二甲苯蓝FF混合指示液 取甲基橙与二甲苯蓝FF各0.1g，加乙醇100ml使溶解，即得。邻二氮菲指示液取硫酸亚铁0.5g，加水100ml使溶解,加硫酸2滴与邻二氮菲0.5g,摇匀，即得。本液应临用新制。茜素磺酸钠指示液取茜素磺酸钠0.1g，加水100ml使溶解，即得。变色范围 pH3.7~5.2(黄→紫)荧光黄指示液取荧光黄0.1g，加乙醇100ml使溶解，即得。钙黄绿素指示剂 取钙黄绿素0.1g，加lv化钾10g，研磨均匀，即得。钙紫红素指示剂取钙紫红素0.1g，加无水硫酸钠10g,研磨均匀，即得。姜黄指示液取姜黄粉末20g，用冷水浸渍4次，每次100ml,除去水溶性物质后，残渣在100℃干燥，加乙醇100ml，浸渍数日，滤过，即得。结晶紫指示液取结晶紫0.5g，加冰醋酸100ml使溶解，即得。酚酞指示液取酚酞1g，加乙醇100ml使溶解，即得。 变色范围 pH8.3~10.0(无色→红)。铬黑T指示剂取铬黑T 0.1g，加氯化钠10g，研磨均匀，即得。淀粉指示液取可溶性淀粉0.5g，加水5ml搅匀后，缓缓倾入100ml沸水中，随加随搅拌，继续煮沸2分钟，放冷，倾取上层清液，即得。本液应临用新制。硫酸铁铵指示液取硫酸铁铵8g，加水100ml使溶解，即得。溴酚蓝指示液取溴酚蓝0.1g，加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml使溶解，再加水稀释至200ml，即得。 变色范围 pH2.8~4.6(黄→蓝绿)。溴麝香草酚蓝指示液取溴麝香草酚蓝0.1g，加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.2ml使溶解，再加水稀释至200ml，即得。 变色范围 pH6.0~7.6(黄→蓝)。麝香草酚酞指示液取麝香草酚酞0.1g，加乙醇100ml使溶解，即得。变色范围 pH9.3~10.5(无色→蓝)。麝香草酚蓝指示液取麝香草酚蓝0.1g，加0.05mol/L氢氧化钠溶液4.3ml使溶解，再加水稀释至200ml，即得。变色范围 pH1.2~2.8(红→黄);pH8.0~9.6(黄→紫蓝)。

1.质量与生物安全管理体系的建立实验室质量管理体系的建立是要有明确的目的及规范的管理，有效的制约和高效的机制， 能自我发展和完善的有机整体。在病原微生物实验室进行的检测工作的质量管理作为单位质量管理体系的有机组成部分有关生物安全方面的特殊要求包括：实验室准入，操作规范， 个人防护、 健康监护、 消毒效果评估， 菌毒种保管， 废弃物处理和意外处置、 实验室生物风险评估等各项生物安全规章制度应编入单位实验室质量体系文件;质量与生物安全管理体系必须确定总负责人， 明确管理部门， 检测部门、 保障部门、 部门职责、 相互关系以及各部门负责人的责任、权利和义务;生物安全管理委员会， 要建立生物安全监督员和内审员队伍， 定期进行生物安全督促检查;要求各部门执行本单位编制的实验室质量与生物安全管理体系文件，并按文件规定的程序开展各项管理活动， 维持体系的运行和改进。2.人员管理实验室生物安全工作的关键是人，实验室人员缺乏实验室生物安全意识， 将在各个环节产生暴露的风险。因此必须大力抓好实验室生物安全人才队伍建设。人员准入病原微生物实验室要严把准入关，用制度保证所有实验人员尤其是客座人员和新工作人员必须接受生物安全防护知识及实验室制度、 安全操作规程以及实验潜在的危险等相关内容培训并考核合格，持证上岗;在操作前签署生物安全《知情同意书》 ，并经实验室负责人批准后方能进入。一般情况下，易感人员或感染后会出现严重后果的人员，不允许进入实验室或动物房， 例如， 身体受到开放性损伤、患发热性疾病以及患有免疫缺陷或免疫抑制的人等。人员培训所有实验人员还必须每年更新知识，接受一次附加培训。培训方式可分为全员培训和专项培训，专项培训又有管理和操作两类。重点在防止气溶胶产生的操作， 锐器操作、 生物安全柜的使用、 防护用品穿戴、 样本运输、意外事故处理、 逃生演练等， 以达到增强生物安全防范意识的目的。健康监护实验室人员的健康监测也是病原微生物实验室实验室的一个重要工作，实验室应充分了解每个病原的生物危害性， 制定健康监护计划， 储备预防性药物。针对致病力、 传播力采取服药、 打免疫针的手段， 进行防范;对患病的实验人员要及时甄别， 只要其临床体征和所从事的病原相关就要进行干预和医疗管理， 提高预警能力。3.菌(毒)种和阳性样本的管理菌(毒)种和阳性样本在流转过程中既要保持生物的原始特性， 还要考虑也是传染源，既要避免意外暴露还要防止恶意利用或生物恐怖袭击。菌(毒)种和阳性样本的保存要按照国家相关规定， 一类或国家规定需上交国家菌(毒)种保藏单位的菌(毒)种应及时交送。对二、 三、 四类菌(毒)种和阳性样本要建立专门的、规范的保管室，实行双人双锁管理制度。注意保存场所和设施应具备一定的防盗能力， 人员进出能得到控制， 备有消毒、 急救和防护用品， 建立检查、 销毁和领用制度， 疑似样本和菌毒种的管理应参照执行。菌(毒)种和阳性样本的运输运送人员应熟悉相关的生物安全知识并采取相应安全防护措施。跨省运输可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)或样本时， 还必须将申请材料报省人民政府卫生主管部门审核同意后， 递交上级相关机构，颁发准运证书后， 方可运送。4.环境与设备管理按国 家标 准《实验室生物安全通用要求》(GB19489 －2008)对实验室生物安全实行分级管理。实验室环境与设施设备要求生物安全二级(BSL － II)实验室是使用最多、涉及最广的生物安全实验室， 除满足生物安全一级(BSL － I)实验室设施和设备要求外， 还应在实验室内配备生物安全柜，高压蒸汽灭菌器、 洗眼设施， 防止节肢、 啮齿动物进入的设计， 有可自动关闭门及可视窗， 防虫纱窗等。确保实验室设备的正常使用实验室设备和消耗材料应确保质量，制定操作规程， 合理使用， 规范操作。高浓度的感染材料必须在生物安全柜操作， 高压灭菌器要考虑放置地点， 锐器的使用和存放也应合乎要求， 消防器具不但在品种上要满足实验室的特殊要求，而且要在保质期内使用。5.废弃物安全管理废弃物安全管理是防止生物安全事件的重要一环。病原微生物实验室的培养物、储存物、 垃圾以及其他废弃物的处理和处置必须以安全为目的， 首先应就地消毒灭菌， 进行无害化处理， 利器还必须置于坚固、 防漏、 有盖的容器，密闭后运出实验室销毁。实验室不但要制定消毒制度，储备消毒剂， 而且要确保消毒剂的有效性并对消毒效果进行判定。6.个人防护和应急预案不同的防护等级要求不同的防护用品及管理要求。在生物安全二级(BSL － Ⅱ)实验室至少应有一套防护用品， 包括头部、 面部、 身体、手部、 足部防护等。实验室常用的防护手套， 防护服应制定一定的保有量和保质期检查制度， 避免到用时才发现没有防护用品或使用过期防护用品的情况。当发生实验室意外时，应执行应急预案， 服从现场指挥官的调度。在物资储备上做好准备， 主要是应急照明、 报警、 维护、 急救和消毒几个方面， 不仅要备好照明灯、报警电话号码、 工具箱、急救箱、 洗眼器、 紧急喷淋器、 消毒器械和消毒剂等物品， 并且在程序上还要对火警、 盗抢、 水险、 设备故障、 样本泄露和人员暴露或感染等各种情况的处理方法进行规定病原微生物实验室的安全性取决于实验人员的安全意识，实验室设施的建设， 防护设备的配置和管理体系的完善。领导重视， 建立管理队伍， 明确职能分工和部门职责， 加强培训和交流， 才能提高管理水平。

移液管是检化验经常使用的玻璃计量仪器，有各种形状，最普通的是中部吹成圆柱形，圆柱形以上及以下为较细的管颈，下部的管颈拉尖，上部的管颈刻有一环状刻度。移液管为精密转移一定体积溶液时用的。移液管的使用诀窍1、使用时，应先将移液管洗净，自然沥干，并用待量取的溶液少许荡洗3次。   2、然后以右手拇指及中指捏住管颈标线以上的地方，将移液管插入供试品溶液液面下约1cm，不应伸入太多，以免管尖外壁粘有溶液过多，也不应伸入太少，以免液面下降后而吸空。这时，左手拿橡皮吸球（一般用60mL洗耳球）轻轻将溶液吸上，眼睛注意正在上升的液面位置，移液管应随容器内液面下降而下降，当液面上升到刻度标线以上约1cm时，迅速用右手食指堵住管口，取出移液管，用滤纸条拭干移液管下端外壁，并使与地面垂直，稍微松开右手食指，使液面缓缓下降，此时视线应平视标线，直到弯月面与标线相切，立即按紧食指，使液体不再流出，并使出口尖端接触容器外壁，以除去尖端外残留溶液。  3、再将移液管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁，使容器微倾斜，而使移液管直立，然后放松右手食指，使溶液自由地顺壁流下，待溶液停止流出后，一般等待15秒钟拿出。    4、注意此时移液管尖端仍残留有一滴液体，不可吹出。刻度吸管的使用诀巧1、刻度吸管是由上而下（或由下而上）刻有容量数字，下端拉尖的圆形玻璃管。用于量取体积不需要十分准确的溶液。   2、刻度吸管有“吹”、“快”两种形式。使用标有“吹”字的刻度吸管时，溶液停止流出后，应将管内剩余的溶液吹出；使用标有“快”字的刻度吸管时，待溶液停止流出后，一般等待15秒钟拿出。  3、量取时，最好选用略大于量取量的刻度吸管，这样溶液可以不放至尖端，而是放到一定的刻度（读数的方法与移液管相同）。

实验原理2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。主要试剂1. BSA2. Bradford液3. DTT4. 0.05% 的溴酚兰5. IPG buffer (pH 3-10)主要设备1. 振荡器2. 高速离心机3. 紫外分光光度计4. 双向电泳设备实验材料纯化后的晶体蛋白实验步骤1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。其中每隔10～15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，-80oC保存。2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80ul），然后，各管中分别加入4ml的Bradford液（原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。(测量过程要在一个小时内完成)。例如：编号        蛋白量（ul）         Buffer(ul)         Bradford(ml)       OD595值1                0                   80                4                02                5                   75                4               0.0243               10                   70                4               0.0614               15                   65                4               0.0915               20                   60                4               0.116Bt4              2                   78                4               0.079Bt4              4                   76                4        转Bt4            2                   78                4               0.075转Bt4            4                   76                4        标准曲线方程式：Y= aX b.其中Y为 OD值，X为蛋白含量。 a、b通过作图输入数据可知，相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得。OD值测量过程：比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。3. 双向电泳第一向---IEF（双向电泳中一律使用超纯水）1) 水化液的制备称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚兰，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。在含300ug 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。2) 点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开Immobiline  DryStrip gels (18cm，pH 3-10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平。3)  IPG聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为20oC）S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step)       共计44110vhs, 19.5小时,其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦。4) 平衡用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干（胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次冲洗过程也可省略），然后用镊子夹住胶条以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入用来平衡的试管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚兰作为标记），用平衡液A，平衡液B先后平衡15min。  注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁。平衡第二次时，在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片，长度与一向胶条的宽度等同，然后吸取煮好的Marker，转入SDS—PAGE胶面上，保持紧密贴合；同样在第二次平衡时，煮5%的琼脂糖10ml。4. 双向电泳第二向---SDS-PAGE1) 配胶(两根胶条所用剂量)分离胶：（T=8%  80 ml）：溶液于真空机中抽气后再加APS和TEMED30 % 丙烯酰胺储液    21.28ml分离胶buffer          20ml      10%APS 220ul     TEMED 44 ul双蒸水               38.72ml浓缩胶：（T=4.8%   10ml）30 % 丙烯酰胺储液    1.6ml浓缩胶buffer          2.5ml     10%APS 30ul     TEMED 5ul双蒸水               5.9ml2) 灌胶将玻璃板洗净后,室温晾干,然后,将电泳槽平衡好,玻璃板夹好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶,倒入正丁醇压胶,凝胶后(这时会出现三条线),用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再用滤纸除水后,倒入浓缩胶,正丁醇压胶,凝胶后,用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再加入超纯水,用保险膜封好。3) 转移剪两个小的滤纸片，吸取Marker后，放入SDS—PAGE胶面的一端。然后，将平衡好的IPG胶条贴靠在玻璃板上,加少量的5%的琼脂糖溶液在胶面上(琼脂糖凝胶在转移前十几分钟的时候配好,水浴加热溶解,并保持烧杯中水处于沸腾状态,至用之前再拿出来),再将IPG胶条缓缓加入SDS—PAGE胶面,其中不断补加5%的琼脂糖溶液,注意不能产生气泡。4) 跑胶浓缩胶  13mA         分离胶  20mA        共约5.5个小时。5. 银染(两根胶条所用剂量)（银染特别注意用超纯水）1)  固定   30min    无水乙醇 200ml 乙酸50ml，用超纯水定容至500ml。2)  敏化   30min    无水乙醇 150ml。Na2S2O3?5H2O  1.5688g无水乙酸钠          34g  先用水溶解Na2S2O3?5H2O和乙酸钠,再加乙醇,最后定容至500ml。3)  洗涤   5min  ×  3次4)  银染   20min     AgNO3   1.25g   用超纯水定容至500ml5)  洗涤   1min  ×  2次6)  显影       无水Na2CO3    12.5g   用超纯水定容至500ml，甲醛(37%)0.1ml, 临时加。7)  终止   10min     EDTA—Na2?2H2O  7.3g  用超纯水定容至500ml。8)  洗涤   5min  ×  3次。注意事项整个双向电泳实验中全部使用超纯水，尽量减少离子的影响。

正确进行培养基质量控制，并作为一项经常性的工作，建立完整的检验资料，是实验室今后通过相应级别的认证，在整个检验质量控制体系中所必须具备的文件资料。1、常用培养基的质量控制检验项目与方法：对新批号的干燥培养基物理、化学及生物学指标鉴定。A：感官（外观）研细程度和颜色（溶解前后），透明度，杂质等。B：PH测定，按各种培养基要求的PH±0.2，蒸馏水的PH应在6.4-7.0之间。C：生物学指标检定，被检培养基相应细菌生长率测试；菌落大小及特征的检测。生长率测试：适用与液体和固体培养基：将菌培养液，用生理盐水做倍比稀释，取合适稀释度进行平板计数或接种被检的培养基试管，同时以按相关的培养基国标配方新鲜配制的培养基进行对照。不低与10%。菌落大小测试：划线分离测试菌，取10个菌落测量直径大小，其直径均值与新鲜配制的培养基无统计学差异。2、常用培养基质量标准外观和理化标准：干粉颜色：淡黄色粉末或呈现本培养基特有的颜色。溶解后培养基色泽：清晰透明（含琼脂除外）淡黄色或特有的色泽。灭菌后的培养基PH：7.2±2℃为多；个别弧菌检验用培养基pH值偏高为：8.0 ±2℃。生物学指标：菌落特征及菌落大小 。3、培养基保存环境制成的培养基保存环境为4℃冰箱，如制成平板则用塑料袋包装置冰箱保存。干燥培养基干粉含有活性物质、遇热易分解的物质应仔细查看存放条件，多数也须放在2-8 ℃条件保存。有的培养基则以存放于10-15 ℃条件为易。如含有高浓度胆盐的培养基。4、培养基制备控制程序培养基配制所用的仪器设备培养基配制所用的仪器设备必须经过相应的鉴定 。配制培养基所用的用具及容器配制培养基所用的用具及容器必须是清洁或是灭菌的，一些特殊不易洗刷清洁的玻璃器皿，必要时可用重铬/酸钾硫酸清洁浸泡后，取出置5%氢氧/化钠溶液浸泡数分钟，再用3%盐酸溶液进行中和，然后用清水冲洗，烘干后备用。5、培养基配制原料，试剂质量控制配制好的培养基（尤其是糖发酵管）不宜久放。因为培养培养基吸收空气中的二氧化碳，会使培养基变酸，从而影响细菌的生长。培养基中的抑制剂及指示剂一定要精确称量，抑制剂要注意合理配伍。6、培养基主要原料的质量控制配制培养基的主要原料有蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、胆盐、无机盐和琼脂等，这些主要原料的有劣，直接影响到培养基的质量，由此也将影响检验质量。

　　由于细菌各自的酶系统不同，新陈代谢的产物也有所不同，而这些产物又各具有不同的生物化学特性。为此，可利用生物化学的方法来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的细菌，这种试验称为细菌的生化反应试验。　　1、在培养物中加入某种底物与指示剂，经接种、培养后，观察培养基的PH值变化。　　2、在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。　　3、根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。　　4、根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。　　生化试验的注意事项　　1、待检菌应是新鲜培养物。培养18-24h。　　2、待检菌应是纯种培养物。　　3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。　　4、应做必要的对照试验。　　5、提高阳性检出率，至少挑取2-3个待检的疑似菌落分别进行试验。　　生化试验分类　　（一）糖类代谢试验　　（二）氨基酸和蛋白质代谢试验　　（三）有机酸盐和铵盐代谢试验　　（四）酶类试验

本文主要对大肠杆菌微生物检测培养基的配方及原理进行了介绍，为化学实验从业人员提供参考！1、 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)原 理：月桂基硫酸钠，别名月桂醇硫酸钠，表面活性作用强，具有乳化作用。一种优质蛋白胨，是以新鲜牛肉和牛骨经胰酶消化，浓缩干燥而成的浅黄色粉末。具有色浅、易溶、透明、无沉淀等良好的物理性状。含有丰富的氮源、氨基酸等胰蛋白胨或胰酪胨 20g 提供碳源和氮源满足细菌生长的需求 。配方：（g/L）2、 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤（Brilliant Green Lactose Bile Broth）原理：胆盐（Bile Salt）：是一种胆酸的钠盐，是胆酸的羧基和甘氨酸或牛磺酸(C2H7NO3S)的氨基(C2H5NO2)，通过酰胺键结合而成。① 可降低培养基与细菌细胞膜界面上的表面张力，使细胞膜紊乱，导致细菌自溶。②肠杆菌科细菌在肠道内长期与胆汁接触。对胆盐有一定的抵抗力。合适的胆盐量能促进该科细菌的生长。③胆盐遇酸生成沉淀，使菌落色素不致扩散从而有利于鉴别。④ 胆盐中含有一定量的胆红素、粘蛋白、色氨酸，对不受胆盐抑制的细菌生长有营养作用。煌绿（亮绿）：抑制革兰氏阳性菌和大多数非沙门氏菌的革兰氏阴性杆菌，通常抑制发酵乳糖、蔗糖的细菌。煌绿和枸櫞酸钠对大腸菌的生长、菌体蛋白质的合成和糖的利用都有显著的抑制作用,以煌绿的作用为较强。枸酸钠能抑制大腸菌的呼吸,而煌绿的抑制作用则较弱。混合胆盐及硫代硫酸钠对大腸菌的上述代谢活动都没有抑制作用。配方：（g/L）用法：将蛋白胨、乳糖溶于约500 ml蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200 ml（将20.0 g 脱水牛胆粉溶于200 ml 蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975 ml，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3 ml， 用蒸馏水补足到1000 ml，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10ml 。121 ℃高压灭 15 min 。3、 伊红美蓝琼脂(EMB)Eosin-Methylene Blue Agar原理：伊红美蓝琼脂含有伊红和美蓝两种苯胺类染料，它们可以抑制革兰氏阳性菌的生长。伊红为酸性染料，美蓝为碱性染料。当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。而产气杆菌则形成呈棕色的大菌落。在碱性环境中不分解乳糖产酸的细菌不着色，伊红和美蓝不能结合，故沙门氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落。金葡菌在此培养基上不生长。常用的伊红美蓝乳糖培养基，可用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌。如果有大肠杆菌，因其强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体带H+，故菌落被染成深紫色，从菌落表面的反射光中还可以看到金属光泽。配方：（g/L）用法：称取本品 37.4g,加热搅拌溶解于 1000ml 蒸馏水中,分装三角瓶,121℃高压灭菌 15分钟, 备用。4、 EC肉汤 (E.Coli Broth)用途：用于粪大肠菌群、大肠杆菌的测定(GB2008、SN标准)配方：（g/L）5、 营养琼脂斜面 营养琼脂（NA）Nutrient Agar用途：细菌计数、不含糖，可作血琼脂基础和传代用(GB标准)。配方：（g/L）

　　自己购买干粉培养基配制后，总是会出现沉淀的现象。现总结可能是以下几种原因。　　一、称量错误　　天平称量不准确、计算称量错误导致配制培养基的浓度不正确，都有可能导致岀现部分沉淀。　　二、水质不佳　　多数培养基的制备需要使用纯化水、去离子水配制，而天然水中含有含有较多的矿物盐离子，若错误的使用了自来水，矿泉水配制，或使用的纯化水离子未除净，都有可能导致培养基灭菌后岀现浑浊现象或沉淀（磷酸盐含量高的培养基更易出现此类问题。　　三、培养基pH不正确　　偏酸或偏碱的pH有可能使培养基中的部分金属离子产生沉淀。　　四、容器不干净　　新开封的容器或容器清洗不干净，内壁留有杂质，都会导致灭菌后的培养基中有杂质出现。　　五、培养基本身有沉淀　　培养基配方中无机盐成分较多，或培养基本身含有不溶性成分，灭菌后会有沉淀存在，此为正常现象，不影响使用。例如MC、TTB、BS等，配方中含有不溶物，灭菌后有沉淀。　　六、溶解不充分　　培养基灭菌前应充分搅拌热至wan全溶解，方可进行灭菌。若灭菌前未将培养基溶解wan全就进行灭菌处理，灭菌后易出现絮状或团块状沉淀，如 Fraser培养基含有大量磷酸盐，若灭菌前未进行充分溶解，灭菌过程中磷酸盐易结成块灭菌后不溶解。　　七、灭菌方式不正确或灭菌过度　　含有不耐热成分的培养基，若灭菌过度或加热过度，都有可能导致灭菌后的培养基颜色不正确或岀现沉淀。如亚硒酸氢钠胱氨酸増菌液(SC)，正常制备好的培养基应为淡黄色透明液体，澄凊无沉淀，若加热过度则培养基中亚硒酸氢钠分最终制备的培养基会出现红色沉淀。　　八、添加剂加入时温度不正确　　卵黄、血液等对温度敏感的添加成分，若加入时温度过高或温差过大，易岀现凝块或絮状沉淀。

  定量分析的任务是测定物质中某种或某组分的含量。  一、定量分析过程通常包括:  1、试样的采取和制备、  2、称量和试样的分解、  3、干扰组分的掩蔽和分离、  4、定量测定和分析结果的计算和评价等  (1)取样:根据分析对象是气体、液体、或固体，采用不同的取样方法。在取样过程中，最重要的一点是要使分析试样具有代表性。试样制备:试样经过破碎、过筛、混匀、缩分后才能得到符合分析要求的试样。破碎分为粗碎、中碎和细碎甚至研磨。每次破碎后要使样品全部通过筛孔。缩分是使粉碎后的试样量逐步减少，采用四分法。将过筛后的试样混匀，堆为锥形后压为圆饼形状，通过中心分成四等份，弃去对角的两份。是否需要继续缩分，可按下述公式进行计算。mQ(kg):试样的最小质量;k:缩分常数的经验值，试样均匀度越差，越大，通常在0.05~1kg·mm-2之间。d(mm):试样的最大粒度直径。·采样与缩分试样量计算示例·例:采集矿石样品，若试样的最大直径为10mm，k=0.2kg/mm2,则应采集多少试样?·解:mQ≥kd2=0.2?102=20(kg)·例:有一样品mQ=20kg，k=0.2kg/mm2,用6号筛过筛,问应缩分几次解:mQ≥kd2=0.2?3.362=2.26(kg)缩分1次剩余试样为20?0.5=10(kg)，缩分3次剩余试样20?0.53=2.5(kg)≥2.26，故缩分3次。从分析成本考虑，样品量尽量少，从分析误差考虑，不能少于临界值mQ≥kd2  (2)试样分解和分析试液的制备  定量化学分析一般采用湿法分析，通常要求将干燥好的试样分解后转移入溶液中，然后进行分离及测定。试样分解和分析试液的制备要求:试样分解完全;待测物质不损失;避免引入干扰杂质。根据试样性质的不同，分解的方法亦不同。  溶解法→无机试样  熔融法→无机试样  微波消解法→无机试样  灰化法→有机试样  (3)分离及测定  根据待测组分的性质、含量和对分析结果准确度的要求，选择合适的分析方法。根据方法的灵敏度、选择性及适用范围等来正确选择适合的分析方法。当试样共存组分对待测组分的测定有干扰时，常用掩蔽剂消除干扰，而无合适的掩蔽方法时，必须进行分离。  (4)分析结果的计算及评价  根据分析过程中有关反应的计量关系及分析测量所得数据，计算试样中待测组分的含量。对于测定结果及误差分布情况，应用统计学方法进行评价。  二、定量分析结果的表示  ⑴待测组分的化学表示形式  以待测组分实际存在形式含量表示。  以氧化物或元素形式表示  以所需的组分表示  电解质溶液的分析结果，以离子含量表示  三、待测组分的含量表示方法  固体试样:常用质量分数表示wB=mB/ms(%)  含量很低时，μg/g(或10-6)，ng/g(10-9)，pg/g(10-12)  液体试样:  物质的量浓度:单位mol/L。  质量摩尔浓度:单位mol/kg。  质量分数:待测组分的质量除以试液的质量，量纲为1。  体积分数:待测组分的体积除以试液的体积，量纲为1。  摩尔分数:待测组分的物质的量除以试液的物质的量，量纲为1。  质量浓度:以mg/L,μg/L,μg/mL，ng/mL,pg/mL。  气体试样:常量或微量组分的含量，通常以体积分数表示。  基础化学中经常用到的定量分析仪器有:高效液相色谱仪、气相色谱仪、分光光度计、常用玻璃仪器(烧杯、量筒、玻璃棒、容量瓶等)、天平等。此外，由于行业不同，应用的分析仪器截然不同，如在生物行业中会用到PCR。

空白试验：除不加试样外，采用完全相同的分析步骤、试剂和用量（滴定法中标准滴定液的用量除外），进行平行操作所得的结果。用于扣除试样中试剂本底和计算方法的检出限。空白做不好会怎样？空白试验测得的结果称为空白试验值。在进行样品分析时所得的值减去空白试验值得到的才是最终分析结果。空白试验是实验室质量控制的重要环节，其准确性对提高检测结果的准确度至关重要。空白试验值反应了测试仪器的噪声、试剂中的杂质、环境及操作过程中的沾污等因素对样品测定产生的综合影响，直接关系到测定的最终结果的准确性。空白试验值低，数据离散程度小，分析结果的精度随之提高，它表明分析方法和分析操作者的测试水平较高。当空白试验值偏高时，应全面检查试验用水、试剂、量器和容器的沾污情况、测量仪器的性能及试验环境的状态等，以便尽可能地降低空白试验值。做酸碱滴定时为什么要做空白试验？因为用作稀释液的空白溶液有一定的酸碱度，会影响滴定结果，所以要做空白试验，来扣除空白的干扰。比如空白溶液为酸性，这时候用碱滴定此溶液，得到的结果会偏高，要扣除空白溶液的酸度，得到的酸度才正确。石墨炉测铅时,空白(4硝酸+1高氯酸GR)值总是较高,与灰化法的结果不大一致（样品为植物样）。【分析】1. 所用的水为用石英亚沸水蒸馏器蒸馏得到的，先打一下空白，一般不会超过0.0015，然后采用的为硝酸（工艺超纯）和高氯酸（优极纯）消化，最后溶解用的1摩尔每升的盐酸或硝酸（结果差不多，只是盐酸稳定性要好一点），定容体积为50mL的话空白值一般为0.03左右。不过铅比较难做，基体干扰很大。2. 空白问题来自多方面，上面说的水与试剂外，你用的氩气是高纯的吗？也可用高纯氮气，但要注意分子带背景3. 可能来自由你所用的硝酸和高氯酸不纯所致。你可以先测空管，然后测你所用的水，再测含酸的水空白看看就知道了4.有可能是试液的酸度过大会影响测定，特别是使用高氯酸，影响更大，酸度大对石墨炉损害也比较大。对于石墨炉测定铅，湿法消化最好使用微波消化，使用硝酸和双氧水，这样空白中酸度比较容易控制，空白也比较低。5. a.实际Pb含量有出入，厂家就没有测准；b.仪器可能没有调制最佳。7.石墨炉测铅使用高氯酸＋硝酸消解的样品测定空白不稳定而且很高这个问题没有分析到点子上。这个故障的实际问题不是试剂不纯引起的，是因为在消解时无论如何赶酸都很难完全把高氯酸除去，因为高氯酸是高沸点酸。这样在最后分析样品时残留的酸就是高氯酸。高氯酸会在石墨炉升温灰化阶段分解出氧气和氯化氢。一方面氯离子会在最后原子化阶段产生非特征吸收，另一方面氧气会和石墨管中的石墨反应烧蚀石墨管。所以石墨管测定含高氯酸的样品损坏速度特别快。相对来说高密石墨管坏的比涂层管和平台管都快的多，基本用不过20次就断了。这可能是造成实验不稳定的真实原因。原子荧光空白偏高原因1.测定介质的选择及浓度的影响选择HNO3、HCl、HClO4、H3PO4和H2SO4等进行了实验，结果表明:以HClO4和H3PO4作介质响应值较低，汞在H2SO4溶液中能得到较大灵敏度，但空白值也高。汞在HNO3和HCl溶液中的荧光强度差别不大。在5%-25%的硝酸和5%-20%的盐酸中荧光强度基本稳定。2.酸的影响作为原子荧光的载流和标准试剂的基体，酸对原子荧光的影响十分的突出。一般在原子荧光中使用的酸主要有两种-盐酸和硝酸。我们习惯上使用盐酸。如果购买市场上质量差的酸，对空白的影响要大得多。3.还原剂的影响作为原子荧光的还原剂，一般使用最多的是硼氢化钾或硼氢化钠，在原子荧光法中，还原剂对样品以及空白值的影响主要体现在它的用量。硼氢化钾浓度不宜超过3.0%。实验表明，当硼氢化钠浓度为1%时，灵敏度和稳定性好，并且有效消除干扰。4.灯电流的影响一般来说灯电流与负高压对原子荧光的影响是同方向的。提高灯电流，空白值就相应的提高。空白值太大的话，可以适当的降低电流值，使仪器的灵敏度降低，减少标准空白的背景值，使所测的数据准确、可靠，但是如果电流过小，灵敏度也将变小，对所测样品的影响就会增加，所以选择合适的灯电流，保证一定的空白值与灵敏度才是关键。5.载气的影响实验表明，当氩气流速较低时，测定的灵敏较高．但结果的变动性加大，实际测定取氩气流速200ml／hifn，此时测定的灵敏度较高，相对标准偏差可以接受。空白色谱柱出峰，什么原因？高效液相色谱，色谱柱是Kromasil C18（15cm*5Um），流动相为10%乙腈和90%三氟乙酸水，走空白色谱柱时在整个保留时间的中间位置出现较大的色谱峰，走了好几针空白，每针的响应都不同，有的很高，有的又很低，但杂峰一直存在，不像是色谱柱里有杂质，用流动相冲洗后依然出现此问题，什么原因？【原因】1.确定检测波长，如果是末端吸收，排除三氟乙酸的干扰。2.使用100%乙腈作为流动相，乙腈作为样品进样，如果为基线，则说明色谱柱及系统完好。3.然后在换流动相为10%乙腈和90%三氟乙酸水，样品为乙腈，如果有上述“中间位置出现较大的色谱峰”，那说明八成问题在三氟乙酸上，或者稀释三氟乙酸的水上。4.如果上述2、3都有“中间位置出现较大的色谱峰”，检查检测器及进样器。5.这些还不能解决，请联系工程师空白乙腈出峰，什么原因？岛津高效液相色谱仪，进空白乙腈，在样品峰位子出现倒峰，进双蒸水在样品峰出现正峰，进样品时有杂峰干扰，我已经排除了水和乙腈的问题，不知道是不是进样池或者检测器污染了，已经整了10多天，还是没效果，请指教原因和解决办法。【分析】液相中出现倒峰，主要原因是样品吸收比流动相吸收小，所以排除影响，不仅要考虑进样系统污染和检测池污染，还要考虑流动相和色谱柱的影响。换一根柱子试试，考察系统的情况，如果照旧，就排除色谱柱的影响，然后更换流动相试试，再以后清洗进样系统和检测池等等。或将色谱柱从系统中断开，直接用乙腈或水做流动相清洗检测器就可以知道是否是检测器受污染，如果基线正常，再检查你的进样系统，样品，前处理是否有问题，如果都没问题，就去检查色谱柱吧。水质分析中氨氮的测定空白值很高的原因实验中纳氏试剂和酒石酸钾钠对空白值的高低影响很大，可能原因如下：1.测定使用的蒸馏水被污染，含有影响实验结果的杂质，比如蒸馏水含氨。2.试管、移液管等仪器没有清洗彻底，这些因素对实验结果也有较大的影响。3.实验所用的无氨水质量不佳，含氨量比较高，导致实验得到的空白值偏高，这是最主要的原因。4.在配制酒石酸钾钠和钠氏试剂时出现较大偏差，导致实验所用的试剂纯度（酒石酸钾钠、钠氏试剂）不佳，从而导致实验得到的空白值偏高。总氮空白值偏高，什么原因？1、试剂的配制碱性过硫酸钾的配制过程十分重要，掌握不好，会影响消解效果，对测定结果产生一定的影响。配制该溶液时，可分别称取过硫酸钾和氢氧化钠，两者分开配制，再混合定容，或者先配制氢氧化钠溶液，待其温度降到室温后再加入过硫酸钾溶解。若二者在一只烧杯中溶于水，应缓慢加水，同时搅拌，防止氢氧化钠放热使溶液温度过高引起局部过硫酸钾失效。2、玻璃器皿的洗涤所使用的玻璃器皿应先用（1+9）盐酸浸泡后，再用无氨水冲洗数次才能使用，否则，也会造成空白值偏高或平行性较差的情况。3、比色时的注意事项该项目的测定涉及两个波长（220nm和275nm），建议在测定完一组样品的同一波长后，再调整到另一波长，统一测定，不要测完一个样品的两个吸光度后再换另一个样品，这样反复调整波长会引起一定的测量误差。4、试剂的选择碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定总氮的过程中，过硫酸钾是至关重要的试剂。首先，试剂的纯度关系到空白值的高低、测定结果的准确度。一般普通分析纯过硫酸钾的总氮含量最高不超过0.005%，但由于试剂质量存在差异，有些厂家、批次的试剂含氮量常常达不到这个要求，致使空白值偏高。因此，有条件的话建议使用优级纯试剂，尽量降低试剂中的含氮量，从而降低实验空白值。5、实验用水及试剂的质量检验若实验的空白值不够理想，则需要对实验用水及试剂进行检验，以选择出含氮量最低的水和试剂，获得理想的空白值。粗蛋白测定空白偏高的影响因素？可以从以下方面考虑：1.配溶液的水换没换；2.看看消化炉的回收率；3.看看蒸馏仪的回收率；4.盐酸在不在保质期内；5.配溶液的硫酸是不是有问题；6.检查催化剂，是不是含有硝酸钾。小结空白试验是实验室质量控制的重要环节，其准确性对提高检测结果的准确度至关重要。以分光光度法空白为例 ，要用相应的实验用纯水或有机溶济作参比，不能用空白实验溶液做参比，以免人为减小空白值，从而掩盖空白实验值的变异。值得注意的是，通过计量认证的实验室，由于检测仪器和玻璃量器定期检定 ，以及采取了全面的质量管理措施，因此，若测定的空白实验值太大，一般是化学药品纯度不够，配制的试液变质或被污染等原因 。应重新配制试液 ，返工重测该批样品，直至空白实验值合格。