关于高效液相色谱柱工作流程、使用注意事项和清洗方法

1、高效液相色谱柱

高效液相色谱柱系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录器等几部分组成。储液器中的流动相由高压泵泵入系统，样品溶液通过进样器进入流动相，由流动相装入色谱柱（固定相）。

由于样品溶液中的组分具有不同的分配系数，因此在两相中相对运动时，经过反复吸附-解吸分配过程后，各组分的运动速度会加快。差异被分离成单独的组分并依次从塔中流出。

2、高效液相色谱柱如何过滤流动相和样品？

流动相通常由水或与有机溶剂混合的缓冲溶液制成。原则上，所有通过色谱柱的流动相都应过滤，但在实际操作中，应根据具体情况而有所不同。

当有机溶剂为色谱纯水、石英亚沸水或其他超纯水时，在能保证水和有机溶剂质量且有机溶剂质量不受污染的情况下，过滤无更具有实际意义。当流动相含有缓冲盐时，过滤是必要的。缓冲液放置一段时间（视环境温度而定，夏季一般不超过48小时，冬季一般不超过1周）。使用前应重新过滤。

制备的样品试液必须经过0.45μm（0.22μm更好）孔径的滤膜过滤，然后才能注入流路系统。注意区分水系统和油系统。两者不能混用，以免滤膜溶解造成污染。

色谱系统中装有流动相的容器和在线过滤器应定期清洗和更换，以防止过滤器因过载而无法过滤。

3、使用高效液相色谱柱需要注意什么？

当你得到一个新的高效液相色谱柱时，你必须先阅读它的说明，然后测量柱效，定期检查柱效，保留新柱上得到的色谱图，记录条件，定期检查谱带展宽的仪器。

如应用于在线监测，应为色谱柱提供在线理化保护，如安装在线过滤器、自装填料高效液相色谱保护柱、预装保护柱等。在线过滤器的作用是防止颗粒在柱头堆积。优点是基本不影响柱效。它通常用于需要高柱效的情况。

经常更换的耗材是滤芯和保护色谱柱的垫圈。作用是防止色谱柱受到化学污染。缺点是大多数保护柱都会影响色谱柱的柱效，尤其是在使用微柱时，常用的是普通自装填料的保护柱。一些新型保护柱的特点是质量好、填料效率高、分析柱效率提高、脏样品负载量大，可以延长保护柱的使用寿命。

连接器可以用手拧紧，不需要工具。节省时间 可以使用多种不同的填充物，主要适用于脏的、复杂的样品背景，如生化样品、环境样品、食品等。

4、高效液相色谱柱为什么会失效？

4.1 填充不良的色谱柱对于填充不良的色谱柱，填充床的压缩通常会导致柱头塌陷，使用一段时间后会导致柱效突然下降。色谱柱的初始评价指标，如塔板数、不对称因子等，往往不能很好地表征色谱柱床的稳定性。这种情绪只能在实际应用中找到。

4.2 压力因素高效液相色谱柱在使用过程中突然的压力波动、机械冲击或温度的突然变化都会影响柱床，导致峰形变差，柱效降低。在进样过程中，进样阀旋转过慢会引起压力波动，色谱柱床层出现裂纹，换柱时也会出现同样的问题。使用填充良好的色谱柱并在较低的柱压下操作，可以大大减少压力波动造成的色谱柱损坏。

4.3 筛板堵塞色谱柱入口筛板堵塞是高效液相色谱柱的常见问题之一，会引起柱压升高、色谱峰拖尾、塔板数减少等问题。通常，分析样品中的颗粒杂质可能会堵塞色谱柱的入口。

因此，分析需要先过滤或离心。乳白色或混浊样品应使用 0.25 m 滤膜处理，或使用注射器过滤器。喷射器和泵密封件的磨损也会带来颗粒。在进样阀和色谱柱之间使用 0.25 µm 或 0.45 µm 的在线过滤器通常可以避免此类问题。

4.4 样品组分的强保留强吸附的样品组分吸附在柱头填料上，会严重影响液相高效液相色谱柱的使用寿命。生物组织或体液的提取物、天然产物等复杂样品，容易造成柱头污染。比较纯的样品一般没有这个问题。在色谱柱应用中，色谱峰的严重拖尾或分裂通常是柱头吸附强保留污染物的表现。

5、如何清洗高效液相色谱柱？

一般的反相色谱，经常使用缓冲盐。白盐对色谱柱的危害更大。如果盐卡在色谱柱中，则色谱柱无用。所以需要洗掉。请记住，每次都需要冲洗干净。如果色谱柱的流动相中没有盐，则无需冲洗。

洗涤方法：反相柱储存在纯甲醇或纯乙腈中，但盐不溶于纯有机相。因此，中间过渡使用甲醇水或乙腈水。

具体使用什么取决于您的流动相。例如，我们可以使用磷酸盐缓冲液-乙腈（70:30）的流动相，所以洗涤时，用10%-15%的乙腈水，1.0ml/min洗涤，至少30min。如果第二天继续使用，则不需要用纯甲醇或纯乙腈密封。如果第二天不使用，用纯有机相密封柱子，以1.0ml/min的相同流速冲洗30分钟。另外，也不是说不清洗就坏了。它会缩短使用寿命。