BIM试剂盒教您如何选择正确的反转录方法

bim试剂盒教您如何选择正确的反转录方法

逆转录pcr(rt-pcr)在实验室中经常被用于检测和量化样本中的rna表达。实验的第一步是通过逆转录(rt)将不稳定的rna转化为互补的dna(cdna)。实际上，rt是许多用于研究rna的分子生物学技术的第一步，因为将不稳定的rna转换为更稳定的dna会使分析更容易、更可靠。对于rt-pcr,有一步法和两步法。
           

   在一步法rt-pcr中，rt反应和pcr扩增是在同一管中进行。将rna模板添加到试管中，加有两种酶(逆转录酶和dna聚合酶)，以及完成反应的所有必须组分。逆转录酶产生cdna产物，然后逆转录酶和cdna变性，dna聚合酶扩增cdna。在一步法中，rt反应由基因特异性引物启动。因此，只有感兴趣的区域被反向转录，然后进行扩增。

   在两步法rt-qpcr中，rt反应与pcr扩增单独进行。首先，rna添加到反应混合物中，混合物包括逆转录酶和oligo-dts (结合mrna的poly-a尾巴)或随机六聚体(或两者都有)，合成cdna。下一步，从管子中取出少量cdna，置于一个新管中，作为pcr的模板与基因特定的引物一起混合。因为rt反应采用随机启动或由oligo-dts进行启动，总rna或总mrna在rt步骤中被转录。尽管这两种方法都能得到最终的结果，但是每种方法都有优缺点。选择哪种方法取决于各种因素。如下总结它们的优缺点。

一步法rt-pcr：
优点: 只需一步，反应发生在单管中，速度比两步法更快，而且需要较少的准备和操作时间。
处理大量样品时易于操作，减少污染的机会。
整个cdna样品都被扩增，灵敏度更高。
缺点: 同一样本只有有限数量的目的基因被扩增。另一个挑战是组分的兼容性，因为一步法需要转录和扩增之间的平衡。
适用性：当时间对于实验很重要时，一般采用一步法。例如，迅速的一步法是rna病毒检测的好方法，结果可以很快得到。也适用于高通量分析。 由于该方法采用基因特异性引物，所以通常是分析低表达水平基因的较好选择。此外，一步法是非常精确的，需要测量表达水平上的细微差异时这是一种常用的方法。

两步法rt-pcr：
优点: 可以分析同一样本的多个目标。
逆转录步骤将样本中所有的rna转换为cdna，可以储存cdna用于后续实验，检测大量基因。
能够分别优化rt和pcr步骤,可以更好地控制实验过程。
因为只有少量的转录材料用于pcr，任何可能从rna分离到rt反应的抑制剂（如乙醇、苯酚或胍盐）都被稀释了。
缺点：它更耗费时间，且带来污染的可能性更高。rt步骤转录所有的rna以相同的效率，选择这种方法时，应该考虑到启动会影响qpcr的结果。例如，以oligo-dts 和随机六聚体启动反应可能会带来不同的结果。因此，对于每个rt反应应该使用相同的条件。
适用性：选择两步方法的最常见原因是对同一样本的多个目标进行分析。第二,当rna的存储是个问题时,最好是进行两步rt-pcr，因为cdna在-20°c是稳定的。此外，当起始材料有限时，使用两步rt-pcr ，通常会有更高的cdna产量。