上海信裕PRRS液相阻断ELISA试剂盒及免疫胶体金诊断试纸条的研制及应用

上海信裕

2016/01/27 14:05

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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS），是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus，PRRSV）引起的以母猪繁殖障碍及仔猪呼吸道疾病为特征的高度接触性传染病。本病自1987年首次报道以来，给养猪产业造成巨大经济损失，我国也于1995年暴发PRRS。自2001年以来，我国许多地区爆发流行了一种原因不明的猪“高热病”，之后一系列的研究证明，引起“高热病”的主要病原为变异的高致病性的PRRSV，故将此病命名为高致病性猪繁殖与呼吸综合征（Highly pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，HP-PRRS）。与PRRSV相比，HP-PRRSV在Nsp2基因编码区的第1447~1449位和1597~1698位发生突变，即在Nsp2蛋白序列中第483位和535-563位有30个氨基酸的缺失，这一点成为鉴别二者的重要指标，通过检测非结构蛋白抗体可区分由 PRRSV与HP-PRRSV引起的感染，为临床诊断提供辅助依据。实验室的检测PRRS感染的方法主要包括病毒分离、回归本动物、过氧化物酶单层试验(IPMA)、血清中和实验(SN)、免疫荧光实验、酶联免疫吸附试验 (ELlSA)、RT-PCR等，这些仍然是监测PRRS并辅助检测的重要方法，但现有的诊断方法费时费力，不适用于快速临床检测或大量检测，而且能快速区分PRRS和HP-PRRS的诊断方法尚少，因此研制出简便、特异并快速的诊断方法十分必要。我国目前应用的PRRS疫苗主要是灭活疫苗和弱毒疫苗，但在种猪场中只能利用灭活疫苗，以避免毒力返强、传毒、散毒以及垂直感染。因此，建立一种可区分野毒感染和疫苗免疫抗体性质的快速现场应用的诊断方法势在必行，为临床综合防控HP-PRRS、种猪净化以及分子流行病学调查提供技术方法。本实验通过合成HP-PRRSV在Nsp2蛋白中缺失的30个氨基酸的多肽，并应用该多肽制备相应的单克隆抗体（简称为缺失段Nsp2单抗）1E9，并应用1E9单克隆抗体研制了可用于快速、特异区分PRRSV感染和HP-PRRSV感染的液相阻断ELISA试剂盒及免疫胶体金诊断试纸条。本实验中的液相阻断ELISA方法在检测过程中对HP-PRRSV、CSFV、PPV、PRV、SI抗血清均无交叉反应，该方法可检测的阳性血清最高稀释度为1:20。应用液相阻断ELISA试剂盒对220份本地血清样品及对应病料进行检测，结果显示阻断ELISA试剂盒检测阳性率为53.2%，商品化ELISA试剂盒检测阳性率为69.5%；而由商品化ELISA试剂盒检测为阴性的样品，液相阻断ELISA试剂盒检测结果亦为阴性；两试剂盒的差异样品数共36份，经 RT-PCR鉴定其中的11份样品为HP-PRRSV感染猪血清，而其余25份样品为经过PRRSV灭活疫苗免疫猪血清。本实验中的胶体金诊断试纸条在检测过程中对HP-PRRSV、CSFV、PPV、PRV、SI抗血清均无交叉反应，该方法可检测的阳性血清最高稀释度为1:10。应用胶体金诊断试纸条对 100份血清样品及对应病料进行检测，结果显示胶体金诊断试纸条与商品化ELISA试剂盒共同阳性样品数为59，共同阴性样品数为35，免疫胶体金诊断试纸条检测为阴性而试剂盒检测为阳性的样品数为6。本课题所研制的液相阻断ELISA方法对该100份样品的检测结果与该试纸条的检测结果相符。通过临床对本地血清样品的检测，结果显示两种检测方法的检测结果基本可信，可推广应用于种猪场定期的血清学监测、及时排除阳性（即PRRSV感染或注射活毒疫苗）种猪，剔除带毒猪，防止疫源地扩大，并及时采用有效防治措施。