细胞凋亡试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用
概述
细胞凋亡是细胞的基本特征之一,在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面都起到十分重要的作用。在正常细胞中磷脂酰丝氨酸(PS)分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。此磷脂酰丝氨酸可与Annexin V, 一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白以高度亲和力相结合。凋亡后期死亡的细胞与其它因素死亡的细胞,虽都可与A nnexin V结合,但死亡的细胞其细胞膜通透,也可被碘化丙啶(Propidium Iodide, PI),一种核酸染料染成红色。 如将Annexin V标以荧光素(RPE、FITC等)作为荧光探针,结合PI, 利用荧光显微镜或流式细胞仪检测,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
试剂盒组成及试剂配制
1. Annexin V-FITC:保存在Tris-HCl (20mM), NaCl(50mM) 缓冲液中,含1mg/ml BSA和0.09% NaN3。
2. Binding Buffer:Hepes(10 mM) /NaOH (pH 7.4), NaCl (140 mM), CaCl2(2.5 mM). 经0.2μm孔径过滤器除菌。 2–8℃保存。
3. Propidium Iodida(PI):50 ug/ml 溶于PBS (pH7.4)中。
操作步骤
实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。
1. 悬浮细胞离心(350g, 3 min)收集;贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集(胰酶消化时间不易过长,以防引起假阳性);
2. 用PBS洗涤细胞二次(350g, 3 min),计数细胞,每样0.1ml 含1~5×105细胞;
3. 用400μL Binding Buffer悬浮细胞;
4. 加入5μL Annexin V-FITC, 混匀,加入5 μL Propidium Iodide,混匀;
5. 室温避光反应10 min;
6. 荧光显微镜下观察或用流式细胞仪检测。
A 荧光显微镜 观察
1. 悬浮细胞染色后,滴一滴细胞悬液于载玻片上,用盖玻片盖上细胞,荧光显微镜下观察。
2. 贴壁细胞可以象悬浮细胞那样染色后, 滴一滴细胞悬液于载玻
片上,用盖玻片盖上细胞,荧光显微镜下观察。
贴壁细胞也可以先在盖玻片上培养(根据盖玻片大小,置于24孔或12孔细胞培养板内),然后诱导细胞凋亡。 染色细胞在细胞培养板内进行。先用PBS冲洗两次,加入400μl Binding Buffer于孔中。再加入5μl Annexin V-FITC与5μl Propidium Iodide,混 匀。避光室温反应10分钟。
3. 将盖玻片倒置于载玻片上,于荧光显微镜下观察Annexin V-FITC绿色荧光信号和PI红色荧光信号。
B 流式细胞仪分析
用流式细胞仪检测,Annexin V-FITC用绿色荧光FITC通道(FL1)检测;PI用红色荧光通道(FL2或FL3)检测,一般选用FL3。
注意事项
1. 避光保存及使用 Annexin V-FITC,Propidium Iodide(PI)。
2. Propidium Iodide(PI)有毒。注意个人保护。
3. 本试剂盒适用于检测活细胞, 不适用于检测组织样本。
4. 处理细胞时要用温和的条件。防止机械损伤细胞及用酶过分消化细胞。
储存 4°C保存,保质期一年。
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