细胞凋亡试剂盒使用说明书

上海信裕

2015/08/17 15:05

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细胞凋亡试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用

概述

细胞凋亡是细胞的基本特征之一，在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面都起到十分重要的作用。在正常细胞中磷脂酰丝氨酸（PS）分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。此磷脂酰丝氨酸可与Annexin V, 一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白以高度亲和力相结合。凋亡后期死亡的细胞与其它因素死亡的细胞，虽都可与A nnexin V结合，但死亡的细胞其细胞膜通透，也可被碘化丙啶（Propidium Iodide, PI），一种核酸染料染成红色。如将Annexin V标以荧光素（RPE、FITC等)作为荧光探针，结合PI, 利用荧光显微镜或流式细胞仪检测，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

试剂盒组成及试剂配制

1. Annexin V-FITC：保存在Tris-HCl (20mM), NaCl(50mM) 缓冲液中，含1mg/ml BSA和0.09% NaN3。

2. Binding Buffer：Hepes(10 mM) /NaOH (pH 7.4), NaCl (140 mM), CaCl2(2.5 mM). 经0.2μm孔径过滤器除菌。 2–8℃保存。

3. Propidium Iodida(PI)：50 ug/ml 溶于PBS (pH7.4)中。

操作步骤

实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。

1. 悬浮细胞离心（350g, 3 min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集（胰酶消化时间不易过长，以防引起假阳性）；

2. 用PBS洗涤细胞二次（350g, 3 min），计数细胞，每样0.1ml 含1~5×105细胞；

3. 用400μL Binding Buffer悬浮细胞；

4. 加入5μL Annexin V-FITC, 混匀，加入5 μL Propidium Iodide，混匀；

5. 室温避光反应10 min；

6. 荧光显微镜下观察或用流式细胞仪检测。

A 荧光显微镜观察

1. 悬浮细胞染色后，滴一滴细胞悬液于载玻片上，用盖玻片盖上细胞，荧光显微镜下观察。

2. 贴壁细胞可以象悬浮细胞那样染色后，滴一滴细胞悬液于载玻

片上，用盖玻片盖上细胞，荧光显微镜下观察。

贴壁细胞也可以先在盖玻片上培养（根据盖玻片大小，置于24孔或12孔细胞培养板内），然后诱导细胞凋亡。染色细胞在细胞培养板内进行。先用PBS冲洗两次，加入400μl Binding Buffer于孔中。再加入5μl Annexin V-FITC与5μl Propidium Iodide，混匀。避光室温反应10分钟。

3. 将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下观察Annexin V-FITC绿色荧光信号和PI红色荧光信号。

B 流式细胞仪分析

用流式细胞仪检测，Annexin V-FITC用绿色荧光FITC通道（FL1）检测；PI用红色荧光通道（FL2或FL3）检测，一般选用FL3。

注意事项

1. 避光保存及使用 Annexin V-FITC，Propidium Iodide（PI）。

2. Propidium Iodide（PI）有毒。注意个人保护。

3. 本试剂盒适用于检测活细胞，不适用于检测组织样本。

4. 处理细胞时要用温和的条件。防止机械损伤细胞及用酶过分消化细胞。

储存 4°C保存，保质期一年。