这样处理ELISA试剂盒实验数据更准确ELISA试剂盒严厉按照试验过程进行ELISA试验，得出试验数据，就需要处理核算数据，做出拟合曲线，核算浓度了。能够借用专业制造曲线软件进行分析，如curve expert 1.3，依据样品的OD值由规范曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用规范物的浓度与OD值核算出规范曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，ELISA试剂盒核算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实践浓度。这儿就介绍一下运用ELISA试剂盒EXCEL进行核算的办法，你只要双击图表，把它输入到图表的数据中，就能够拟和曲线。依据曲线方程式，核算出浓度。ELISA试剂盒办法：1、拟和曲线：输入榜首行： 浓度值， 如0 10 50 100 400输入第二行：该浓度下的调整后的od值，如0 0.586 1.397 1.997 3.42挑选这些输入的数据，用插入里的图表按钮，进入图表导游，在“规范类型”中挑选“xy散点图”;在“子图表类型”中挑选“折线散点图”，按“下一步”;挑选“系列发生内行”，按“下一步”;数据象征，能够填写：如数据y轴，OD值;数据x轴，浓度;按下一步，点击完结。可得曲线图。单击曲线，按右键，挑选“增加趋势线”，ELISA试剂盒在类型中，挑选多项式;在选项中，挑选显现公式，挑选显现R平方值。得到公式和R平方值。也能够用上面说的办法： 双击图表，把它输入到图表的数据中，就能够拟和曲线。2、核算浓度：榜首次试验：ELISA试剂盒规范曲线为：y = -4E-05x2 + 0.026xR2 = 0.9745为例，ELISA试剂盒已知OD值，核算浓度。因为y = -4E-05x2 + 0.026x，能够得到：4E-05x2 -0.026x +y=0ax2 +bx +y=0

                         授权书北京天恩泽基因科技有限公司授权：上海信裕生物科技有限公司负责北京天恩泽(TIANDZ）的品牌所有产品在上海区域为独家总代理销售及售后服务。总代有效期：2017年3月1日到2018年3月1日  特此证明！                                         北京天恩泽基因科技有限公司                                2017年3月1日

ELISA试剂盒实验时瓶盖和滴管的放置ELISA试剂盒实验如需少数液体试剂则能够用滴管取用，取用时留意不要将滴管碰到或刺进接收容器的壁上或里边。为了确保试验成果的准确性，取用试剂时应当遵从以下规矩，来确保试剂不受污染和不蜕变：已取出的试剂不能再放回原试剂瓶内。别的取用试剂时应本着节省精力，尽可能少用，这么既便于操作和仔细观察景象，又能得到较好的试验成果。称量时，则用称量瓶在天平上进行称量。ELISA试剂盒实验液体试剂痛常用量筒量取，量筒的容量为：5mL、10mL、50mL、500mL等，使用时要把量取的液体写入量筒中，视野要与量筒内液体凹面的最低处坚持水平，然后读出量筒上的刻度，即是液体的体积。试剂不能与手接触。尽可能少用。要用洁净的药勺，量筒或滴管取用试剂，肯定禁绝用同一种东西一起接连取用多种试剂。取完一种试剂后，应将东西清洁洁净（药勺要擦干）后，才能够取用另一种试剂。ELISA试剂盒实验取用后必定要将瓶塞盖紧，不可放错瓶盖和滴管，绝不能破绽百出，用完后将瓶放回原处。

ELISA试剂盒实验温育时温度的选择ELISA试剂盒色彩的深浅和样品中的浓度呈比例关系。这即是为何ELISA检查试剂盒反响总是需求必定时刻的温育。温育常选用的温度有43℃、37℃、室温文4℃（冰箱温度）等。以抗体包被的夹心法为例，参加板孔中的标本，其中的抗原并不是都有平等的和固相抗联系的时机，为加速反响，可进步反响的温度，有些试验在43℃进行，但不宜选用更高的温度。只有最靠近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体触摸。这是一个逐，因此需经分散才能到达反响的终点。在其后参加的酶符号抗体与固相抗原的联系也相同如此。37℃是试验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体联系的适宜温度。ELISA试剂盒属固相免疫测定，抗原、抗体的联系只在固相表面上发生。在树立ELISA办法作反响动力学研讨时，试验标明，两次抗原抗体反响通常在37℃经1-2小时，产品的生成可达顶峰。抗原抗体反响4℃更为完全，在放射免疫测定中多使反响在冰箱中，以形成最多的沉积。再通过温育和洗刷，去掉未联系的酶联系物，然后参加底物A、B，和酶联系物一起效果。但因所需时刻太长，在ELISA检查试剂盒中通常不予选用。ELISA试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）.已知浓度的规范品、不知道浓度的样品参加微孔酶标板内进行检查。先将生物素符号的抗体一起温育。ELISA试剂盒洗刷后，参加亲和素符号过的HRP。

日本研发出可促进神经再生的生物3D打印导管近日，日本京都大学的研究人员使用生物3D打印机创建管状导管，可以促进受损的神经细胞再生。据悉，该研究小组使用的来自CyfuseBiomedical的Regenova3D生物打印机。来自CyfuseBiomedical的Regenova3D生物打印机对普通研究实验室来说可能太贵了，但似乎任何给予机会使用生物3D打印机的人最终都将利用该技术进行一些重要的科学发现。使用Cyfuse生物医学设备的最新研究项目涉及创建一个“使用人类纤维细胞开发无支架的生物3D导管”。这些微小的管状结构被用于促进老鼠的神经再生，并且最终可以用于人类的类似目的。2月13日，在PLOSONE上发表的一篇研究论文中显示，京都大学的研究人员解释了他们如何使用CyfuseBiomedicalRegenova生物3D打印机从人真皮层纤维细胞开发出6个无支架的导管。研究者然后在12只有免疫缺陷的成年雄性老鼠身上进行实验，具体操作就是在大腿中部切除每个老鼠的右坐骨神经的小部分。研究人员在六只老鼠身上使用8mm3D打印导管桥接神经中的5mm间隙；对于其他六只，使用当前标准的硅管。令人兴奋的是，京都大学的研究人员发现，3D生物打印导管有助于促进老鼠的神经再生，速度比硅胶管更快，这进一步表明生物3D打印导管有一天可以用于帮助患者的神经损伤恢复。研究人员测量了老鼠的跖骨摆动、肌肉动作电位和神经细胞表达，发现生物3D打印导管更好地改善所有计数的恢复。还发现胫骨前肌的湿肌重在3D生物打印组中比硅树脂组高。根据他们的发现，日本研究人员确定生物3D打印导管可以有效地促进神经再生。“我们确认，完全由纤维细胞组成的无支架的生物3D导管可以促进大鼠坐骨神经模型中的神经再生，”研究论文中写到。如果项目的成功可以重复人类科目，京都大学和Cyfuse生物医学进行的3D生物打印研究可以对医疗世界产生重大影响。仅在日本，由于工作事故和其他原因，每年有5，000至10，000人患有神经损伤。该项目预期在2019年进行临床试验。

生物标记物将影响精准医疗等5大医疗领域2016年，默沙东和百时美施贵宝的癌症免疫治疗药物Keytruda及Opdivo全球销售额分别为14亿美元及38亿美元，而随着适应症的进一步扩大以及免疫疗法更多深入人心的试验数据的公布，必将会吸引更多的医生及患者去选择这种通过激发人体自身免疫系统的方式对抗肿瘤细胞。上述两个治疗药物的成功，带来了人们对程序性死亡因子配体1（PD-L1）的大量关注，但是在实际药物治疗上，这些免疫检查点抑制药物只在在某一些癌症患者中具有疾病缓解和生存期的延长作用，而对于另外一些患者，这些药物则几乎没有治疗效果。研究已经证实：虽然PD-L1的表达水平与疾病应答的关系仍没有能够被详细阐明，但是PD-L1高表达的癌症患者的确会有更高的疾病缓解。因此，在临床实践中，对PD-L1进行检测可以筛选出潜在的药物治疗应答人群。生物标记物PD-L1的表达水平能够预测治疗效果，同理，生物制药行业中，生物标记物的作用将越来越广，不仅可以应用于癌症的治疗上，同时在其它领域也已经大有作为。下面是生物标记物影响下的5大医疗领域：1. 精准医疗精准医疗，即通过患者的特殊基因性质、个人体质和生活方式的获取来进行有针对性的个性化的治疗，是医疗界长期以来的治疗目标。然而，长期以来，这种目标一直是难以完成的梦想。随着人类基因测序技术的发展，让精准医疗的梦想走向了现实，并且在很大程度上减轻了患者的治疗负担。无论病人所患的是癌症还是罕见疾病，亦或是类似慢性创伤性脑病的神经退行性疾病，相关生物标记物均能够帮助临床医师和医生更好的诊断出相应的病患。不仅诊断的方式更加简单，而且可以通过诊断筛选出与特殊疗法相匹配的的目标患者，从而实现更好的临床疗效及预后，相比传统的一刀切治疗手段具有更大的治疗优势。2. 组合疗法免疫疗法是近三年医药界研究最为火热的领域。针对各种类型的癌症患者，通过免疫联合疗法能够获得更佳的治疗效果，而医疗界也已经非常清楚的意识到了这一点。目前，全球有数以百计的联合治疗的临床试验在如火如荼的进行着，但是在试验前找到与相匹配的患者却延缓了这些临床试验的进程。与特殊肿瘤类型相关的生物标记物的识别更能体现联合治疗的价值，可以根据患者的生物标记物类型的不同，将他们分到不同的治疗组，临床医生从而在知晓患者生物标记物的基础上，可以更有针对性的进行联合治疗的施用。3. 伴随诊断虽然诊断检验用于检测像是细菌感染这样的疾病已经有很长的历史了，但是随着人类基因测序技术的发展，实验室诊断检验领域也正经历着全新的转变。上市药物的伴随诊断设备过去是很稀少的，但是现如今，对于制药公司开发一个药物后，同时跟随上市相对应的伴随诊断设备已经是司空见惯。当几十年前伴随诊断设备首次登上舞台时，整个医药行业对其持有很大的疑虑，主要担心伴随诊断设备会区分界定病患，将会缩减上市药物的销量。但是像是赫赛汀（注射用曲妥珠单抗）以及格列卫（伊马替尼）这样的重磅药物已经证明这种疑虑是错误和多余的。4. 液体活检液体活检技术可以通过一小管的血量就能检测肿瘤和癌症，属于辅助治疗的突破性技术，目前已逐步进入临床。该技术具有非常诱人的发展前景，因此已经有很多公司及投资机构进入到了液体活检的开发阵营。液体活检相比传统的组织活检，是一种非侵入式的血液测试，能监测肿瘤或转移灶释放到血液中的循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA片段。目前液体活检技术主要应用于针对患者的治疗策略的选择上，将治疗方法与疾病突变类型相匹配，同时可以监控晚期癌症患者的疾病进程。但是Grail（格瑞）公司及GuardantHealth公司已经将液体活检技术推进到了疾病的更早期检测阶段。Grail公司是测序巨头Illumina的附属公司，由它开发的活检技术已经可以用于检测没有症状的多种癌症的筛选试验。虽然液体活检技术应用于无症状癌症的筛选仍有很长的路要走，但是该技术对于加快了临床试验的入组确是有目共睹的。大量的资本涌入液体活检领域，下一个十年将是液体活检获得丰收的关键期。5. 癌症的罕见化美国前总统奥巴马在2015年首次提出精准医疗计划，旨在进一步加强对人类基因的认知并加速针对每个癌症个体的精准治疗方法的开发。虽然今天的美国政府已经有其它的政策侧重，但是去年12月份国会一致通过的21世纪治愈法案仍将会支撑美国的医疗创新。其它的像是美国前副总统JoeBiden的价值几十亿美元的旨在攻克癌症的“登月计划”也会在下一个十年里带来行业突破。政府政策对医疗发展的倾向增强了人们对能够真正精确治疗疾病的医学发展的信心。靶向治疗已经问世多年，但是该疗法也仅仅是在揭示了疾病（例如癌症）基因谜团之后才兴起和发展起来的科学。优化的基因测序技术、癌症免疫疗法以及更优良的诊断工具将让癌症的治疗选择变得更加多样而有效。不仅仅是器官级别的进行肺部肿瘤或前列腺肿瘤的治疗，同时对于其中特定的基因突变进行分子基础的治疗。美国国家癌症研究所目前正在进行一项名为MATCH的大型的临床试验，旨在使用基于分子突变的靶向药物治疗研究，而不再使用已经批准的适应症针对性药物去治疗相关疾病。美国临床肿瘤学会同样在进行相类似的TAPURstudy试验。针对特定疾病进行精确性和针对性的治疗，其价值已经远远超过了概念本身，但是要想看到精确性治疗的实际成效仍需要很长的路要走。

利用CRISPR/Cpf1改进大豆油中的脂肪含量在一项新的研究中，来自韩国基础科学研究所（Institute for Basic Science, IBS）基因组工程中心的研究人员利用新的CRISPR-Cpf1技术成功地对改变大豆油中的脂肪含量的两个基因进行编辑。CRISPR-Cpf1是一种更为广泛使用的基因编辑工具CRISPR-Cas9的替代性方法。这种新的植物基因编辑方法对大豆和野生烟草基因进行编辑取得的结果于2017年2月16日在线发表在Nature Communications期刊上，论文标题为“CRISPR/Cpf1-mediated DNA-free plant genome editing”。CRISPR-Cas9是第三代基因编辑系统，已被广泛地用于全世界的生物学实验室中。它由酶Cas9和CRISPR-RNA（crRNA）组成。Cas9发挥着一种“基因剪刀”的作用。crRNA引导这种“基因剪刀”在合适的位点对DNA进行编辑。在此之前，IBS研究人员利用Cas9的替代物Cpf1对人细胞中的DNA进行编辑。这次，他们努力对植物基因进行编辑，成功地将CRISPR-Cpf1复合物导入到植物细胞中。IBS研究人员设计CRISPR-Cpf1复合物对大豆中的两个FAD2基因进行切割。这两个基因是将油酸（一种脂肪酸）转化多不饱和亚油酸（另一种脂肪酸）的通路的一部分。通过让这两个FAD2基因发生突变，大豆种子中的油酸比例增加了，这导致更加健康的脂肪含量产生。IBS研究人员也证实CRISPR-Cpf1并不能够切割大豆基因组中的非靶标位点。这些结果证实CRISPR-Cpf1是一种高度有效的技术。再者，这种方法是100%的不含有DNA（DNA-free）。它通过化学合成crRNA而无需导入外源DNA。这消除了外源DNA（用作RNA合成的模板）残留的风险。IBS研究人员也发现相比于CRISPR-Cas9，CRISPR-Cpf1具有至少三种益处：CRISPR-Cpf1技术具有更短的crRNA，因此能够化学合成这种RNA；CRISPR-Cpf1在靶基因上产生更大的序列删除（7个碱基对），因而让这种基因完全失去作用；Cpf1的切割类型可能有助优化基因编辑过程。KIM Jin-Soo教授解释道，“CRISPR-Cpf1可能被用作一种新工具来开发有附加值的作物，比如一种新的大豆品种，具有下降的不饱和脂肪含量。”

震惊！公共数据库存在非常高的测序错误在一项新的研究中，来自新英格兰生物学实验室公司（New England Biolabs Inc., 简称NEB）的一个研究团队发现储存在公共数据库中的DNA测序样品具有比期待中更高的低频突变错误率（low-frequency mutation error rate）。他们描述了他们如何开发出一种能够计算DNA测序样品中错误率的算法，以及当在两种公共基因组数据库中运行时，它揭示了什么。相关研究结果发表在2017年2月17日的Science期刊上，论文标题为“DNA damage is a pervasive cause of sequencing errors, directly confounding variant identification”。当研究DNA在导致癌性肿瘤（cancerous tumor）的细胞突变中的作用时，研究人员依赖于储存测序信息的数据库的准确性，比如当尝试着找出趋势时，依赖于这些数据库中的信息寻找共性的那些研究人员。这些研究涉及对发生低频突变的不同人的基因组与总体人口的基因组进行比较，并且利用他们发现的结果构建癌症数据集。但是如今，NEB团队开展的这项研究对公共数据库的准确性提出质疑。为了测量一种给定的数据集的准确率，NEB团队开发出一种算法，该算法能够被用来计算因测序过程期间发生DNA损伤而表现出突变（不是自然发生的突变）的序列数量。该团队随后利用他们的算法计算几种公共数据库（最为知名的是千人基因组计划和TCGA数据库的一部分）的错误率，他们报道他们发现这两种知名数据库的错误率分别是41%和73%。NEB团队注意到他们的算法不能够揭示出这些非自然发生的DNA损伤的来源，但是提出它可能是由于在进行测序之前使用的某些样品制备技术导致的。他们也指出为测序仪开发出的其他算法能够测试它们自己的测序错误，但是由于缺乏非常有说服力的理由，它们并没有被广泛地使用。他们指出DNA测序仪开始这样做了。他们也注意到已在开发的新工具可能有助在制备期间让DNA损伤最小化，而且它们的使用可能改进公共数据库的准确性。

揭示TMEM24调节胰岛素分泌机制血糖触发胰腺中的β细胞分泌胰岛素，这一过程在糖尿病中受到破坏。糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。糖尿病通常分为1型糖尿病和2型糖尿病。1型糖尿病即胰岛素依赖性糖尿病。感染(尤其是病毒感染)、毒物等因素诱发机体产生异常自身体液免疫应答和细胞免疫应答，导致胰岛β细胞损伤，胰岛素分泌减少，多数患者体内可检出抗胰岛β细胞抗体。2型糖尿病又称非胰岛素依赖糖尿病。2型糖尿病患者的胰腺并不能够产生足量的胰岛素或者机体细胞对胰岛素并没有反应，这就意味着停留在血液中的血糖并不能被机体当做能量来使用。在一项新的研究中，来自美国耶鲁大学和新加坡国立大学的研究人员在这些胰腺β细胞的细胞膜中鉴定出一种控制它们分泌胰岛素的机制。相关研究结果发表在2017年2月17日的Science期刊上，论文标题为“Lipid transport by TMEM24 at ER–plasma membrane contacts regulates pulsatile insulin secretion”。这种胰岛素分泌部分上依赖于一种被称作TMEM24的脂质转运蛋白。TMEM24将一种被称作内质网（endoplasmic reticulum, ER）的细胞器附着到外层细胞膜上。这种蛋白将内质网中制造的脂质携带到细胞膜上，改变它的组成，从而允许胰岛素分泌到细胞外面。这项研究对调节葡萄糖反应性的胰岛素释放机制提出新的认识。这项研究是由耶鲁大学细胞生物学教授Pietro De Camilli和Karin Reinisch、博士后研究员Joshua Lees和助理研究员Mirko Messa合成完成的。

新研究为黑色素瘤精准治疗提供潜在靶点一旦肿瘤消耗完原发灶所有的氧气和营养成分就会向身体其他部位发生转移寻找更多营养供给。来自美国NIH的研究人员对HIF1a进行了新的研究，该分子在许多种癌症中发挥氧气和营养成分感受器的作用。他们发现了40个新基因能够被 HIF1a开启或关闭，10个基因与黑色素瘤从原发灶向身体其他部位转移所需要的时间有关。他们将最新研究成果发表在国际学术期刊 Pigment Cell and Melanoma Research 上。“这些在原发黑色素瘤中新发现的基因和信号通路可以帮助研究人员开发精准治疗所需要的新靶点，还可能用于其他癌症的治疗，”文章作者Stacie Loftus 博士这样说道。“除此之外，基因表达的变化（开启或关闭）还可以在未来用于预测癌细胞如何以及何时发生扩散，以及肿瘤的生长速度。”当黑色素细胞发生恶性转化就会出现黑色素瘤。紫外线可以损伤皮肤细胞的 DNA 引起黑色素瘤。如果能够在黑色素瘤细胞离开皮肤进入淋巴结以及身体其他部位之前发现它，病人的五年生存率可以达到91.5%。而如果在比较晚期发现这种癌症，那么病人的五年生存率将只有30%~60%。当肿瘤细胞生存的环境缺乏氧气和营养物质，它们就会收到信号告诉细胞是时候转移到其他部位寻找新的营养供给了。发现哪些基因能够定义这个关键的阶段可以为研究人员和医生们提供确定这个阶段的生物标记物。这些生物标记物可以帮助确定肿瘤的发展阶段，帮助进行诊断和治疗方法的选择以及监测疾病复发。Dr. Loftus 表示：“在许多方面黑色素瘤的治疗都是精准医学的典型代表。目前的临床治疗方法主要聚焦在靶向肿瘤的基因变化，帮助免疫系统对抗癌细胞。而发现细胞如何应答周围环境也会获得重要信息帮助指导治疗方法的选择。”在他们下阶段的工作中，研究人员将进一步分析HIF1a 以及其他转录因子在黑色素细胞和黑色素瘤细胞中的作用。他们还会进一步探索受低氧调控的新发现基因帮助理解肿瘤的进展过程。

Wnt5a促进胶质母细胞瘤获得侵袭表型近日，来自意大利的科学家们在国际学术期刊Cancer Research上发表了一篇文章，他们在文章中证明Wnt家族成员Wnt5a是促进胶质母细胞瘤发生侵袭的一个重要因子。该研究为阻止胶质母细胞瘤侵袭治疗这种恶性疾病提供了一个新的潜在靶点。胶质母细胞瘤的脑侵袭情况决定了病人的预后，复发和死亡情况，但是到目前为止还没有发现能够协调胶质母细胞瘤侵袭特性的主要因子。在这项研究中，研究人员报道称参与非经典WNT信号途径的WNT家族成员Wnt5a发挥了上述作用。他们发现侵袭性最强的神经胶质瘤存在Wnt5a过表达的特征，Wnt5a的过表达与病人不良预后相关，同时还将具有很强浸润性的间质样胶质母细胞瘤（mesenchymal glioblastoma）与几乎不运动的原神经胶质母细胞瘤（proneural glioblastoma）和经典胶质母细胞瘤（classical glioblastoma）区分开来。Wnt5a的过表达与间质样胶质母细胞瘤的肿瘤干细胞样特征相关。抑制间质样胶质母细胞瘤中Wnt5a的表达能够削弱肿瘤细胞的浸润能力。相反，在经典胶质母细胞瘤和Wnt5a低表达的间质样胶质母细胞瘤中增强Wnt5a的表达水平能够激活肿瘤细胞的侵袭能力和间质样特征。在胶质母细胞瘤异种移植小鼠模型体内抑制Wnt5a的活性可以阻止肿瘤细胞在脑部的侵袭，增加小鼠的存活率。总得来说，这些结果表明Wnt5a是促进胶质母细胞瘤发生脑部侵袭的一个主要调控因子，该研究为胶质母细胞瘤的治疗提供了一个潜在治疗靶点。

多吃辣椒真的会有利于机体健康！ 提起辣椒，相信很多人莫名地会流口水，油泼辣子、辣子鸡丁等等美食中不可或缺的就是辣椒，辣椒不仅能够作为人们日常生活中必不可少的调味品，而且其对机体健康也有着重要的作用，下面小编就盘点了辣椒对机体健康的诸多好处，分享给各位。【1】研究发现吃辣椒可预防肠道肿瘤科学日报报道，美国加州大学圣地亚哥分校的研究人员报告称饮食辣椒素——辣椒里的活跃成分——会导致老鼠肠细胞皮层受体的慢性激活，从而引发一种反应，这种反应可减少大肠肿瘤的风险。这项发现被发表在8月1日的期刊《临床研究》上。名为trpv1的受体或者离子通道最初发现于感官神经元，它作为抵抗环境里热量、酸性和辣的化学物质的守卫。“这都是对细胞潜在有害的刺激物。” 研究高级作者、医学教授埃亚勒·拉斯（eyal raz）这样说道。“因此，trpv1被描述为分子‘痛苦感受器’。”这可以被认为是它的传统功能，全部发生在神经系统里。然而，拉斯和同事发现肠的上皮细胞也会表达tprv1，它主要是通过表皮生长因子受体或者egfr来激活。egfr是肠道细胞增值的一种驱动力，大约每4到6天上皮层就会发生更新替换。“为了维持内脏里正常细胞的更新，必须保证egfr活动的基本水平，”研究第一作者、美国加州大学圣地亚哥分校和荷兰乌德勒支大学医学中心的彼得勒斯·德·容（petrus de jong）这样说道。“然而，如果efgr的信号无限制，那么零散肿瘤发展的风险就增加了。” 【2】科学家称常吃红辣椒有助于延长寿命晚餐吃咖喱或炒饭不仅会增添夜间的乐趣，还可以延长您的寿命。据英国《每日邮报》报道，来自加州大学的科学家称经常吃红辣椒有助于减轻疼痛感，延长寿命。近日科学家们通过实验得出了以下的结论：红辣椒会阻断疼痛信号到达大脑，从而延长寿命。多吃红辣椒，能降低患癌几率，减缓年龄的增长引起的记忆力减退，不需要过多运动就可以燃烧卡路里，新陈代谢的能力始终如一，甚至还可以降低患糖尿病的风险。总之，多吃红辣椒有助健康。在加州大学的研究员安德鲁·迪林教授进行的一项实验中，动物的基因被改造了，致使它们体内辣椒素受体(trpv1)缺陷，从而无法感受疼痛感。安德鲁称：“经常吃辣椒，辣椒辛辣的味道会刺激体内的化合物，从而使传感器停止工作。此外，慢性摄入影响辣椒素受体的食物如辣椒素化合物等可以减缓随着年龄增长导致的新陈代谢速度下降，延长人类的寿命。”【3】吃辣椒降低帕金森病风险《神经病学年鉴》杂志刊登一项新研究发现，吃辣椒可以有效降低帕金森病的风险。美国华盛顿大学研究人员调查了490名新确诊帕金森病患者，并将其与644名没有罹患该病的参试者进行了对比研究。所有参试者均被要求填写问卷。问题包括是否经常吃某些蔬菜、烟龄、目前是否吸烟等。结果发现，他们所吃的茄科蔬菜(包括番茄、土豆、柿子椒和茄子等)数量越多，患上帕金森病的可能性就越低。这种关系在辣椒中体现最为明显，每周吃两次辣椒的人患上帕金森病的几率降低了30%；每周吃辣椒5—6次可使帕金森病风险降低大约50%。研究人员认为，这可能归功于茄科属蔬菜中含有的尼古丁。曾经有研究证明，尼古丁和吸烟与降低帕金森病患病风险存在联系。但新研究负责人苏珊·尼尔森博士指出，尼古丁可以治疗帕金森病还言之过早，功劳是否应归功于尼古丁还并不确定，辣椒中可能还包含比尼古丁更重要的物质。 

人与狗的交流存在“误会”？研究者们发现：我们通常与狗狗互动时发出的高音调的声音可能会让小狗崽们感到愉悦，但年龄较大的狗们则不会太感冒。在这项研究中，研究者们观察了人们通常与宠物狗交流的方式，他们发现这种类似于婴儿叫的方式不仅听上去刺耳，而且对于年长的狗类也确实没有什么作用。他们将这种逗狗的叫声称作"婴儿叫"，这是因为它十分类似于我们在与婴儿交流时发出的高音调的声音。不过，这种类型的交流虽然看上去没有什么意义，但对于婴儿阶段的生长发育则具有重要的意义。来自纽约城市大学的Nicolas Mathevon等人认为，与婴儿进行这种方式的交流能够有助于唤醒与保持他们的注意力。研究表明，7周左右的婴儿就已经表现出了对高音调交流方式的喜爱。因此，高音调的交流方式一直被认为能够更多地增强婴儿的听觉能力，这意味着通过这种方式能够更好地让婴儿学习信息。奇怪的是，我们在跟宠物狗交流的时候也会用到这种音调，但这种交流方式是否有效目前仍不得而知。这种高音调的交流方式真的是能够促进人们与宠物狗的感情吗，或者仅仅是人们一厢情愿的做法呢？为了研究清楚这一问题，Nicolas Mathevon等人招募了30名女性进行研究。他们让这些女性观察了90张不同的狗的照片，其中30只为小狗崽，30只为成年狗，另外30只为老年狗。之后，研究者们让这些女性试着发出一些逗狗的语言。结果显示，女性偏爱于向所有犬类进行高音调的呼唤，这与他们跟婴儿交流采用的方式十分相似。而对于听到这些声音的狗类来说，小狗崽似乎更愿意倾听这样的声音，而成年的犬则没有明显的反应。这些发现表明，虽然我们人类经常会使用这样的语言去逗狗，但尽管这些声音对小狗崽有一定的吸引力，但总体来说并不能达到人们的预期。

2017上海信裕春节放假通知 敬爱的客户及各位同事：　　根据《国务院关于修改全国年节及纪念日放假办法>的决定》，现将企业有关春节放假时间安排通知如下：春节：2017年01月22日至2017年02月04日（初八），共13天。其中，1月28日(初一)、1月29日(初二)和1月30日(初三)这3天为法定假期。放假期间，请各部门务必做好安全防范工作。为保证过节和业务两不误,本公司真诚提醒您注意以下事项;: 1.放假期间我司将不安排出货和业务事宜,若贵司有订货需要,请配合在放假前后加理! 2.如贵司在年前有订单需求,请及时下达采购订单或交货排程式,以便于我司备货 ! 谢谢! 新的一年,我们将以最优质的服务为您提供更全面的合作.再次感谢尊敬的客户，同事们对本公司一直以来的关注与支持! 在此向各位新老客户和广大朋友们拜个早年!预祝大家新春愉快!财源广进!事业红火!  特此通知。 　　                        上海信裕生物科技有限公司 　　                                                        2017年1月17

线粒体与核内基因交流 借助表观遗传途径促进肿瘤进展线粒体作为细胞的能量工厂经常在癌症，衰老，神经退行性疾病和心脏疾病中发生异常。线粒体发生的变化是否与癌症扩散存在真正联系一直存在争议。在一项发表在国际学术期刊Cell Discovery上的最新研究中，来自宾夕法尼亚大学的研究人员发现线粒体借助一个新机制影响细胞核内与肿瘤进展相关的基因表达。参与该机制的一种蛋白能够响应线粒体氧化或代谢应激，进而影响表观遗传过程。利用化合物阻断这种相互作用，就可以降低癌基因的表达。“我们的研究证明线粒体功能与细胞核内基因表达存在关联，”Narayan Avadhani教授这样说道。“我们知道这种信号对癌症进展的早期阶段有直接作用，参与其中的蛋白会是阻断这条信号甚至阻断癌症进展的好靶点。”Avadhani的研究小组已经发表了一些文章提出证据表明减少线粒体数目或破坏线粒体功能会促进癌症发展，他们认为线粒体会触发一个应激信号向细胞核发出预警。研究人员将他们的注意力放在hnRNPA2蛋白上，他们之前曾经发现该蛋白能够应答线粒体应激，也与细胞核内DNA有密切关联。hnRNPA2是一个RNA结合蛋白，最近被证明参与癌症进展。研究人员在降低了线粒体数目的细胞内改变hnRNPA2活性，进一步研究该蛋白在线粒体-细胞核交流过程中发挥的作用。他们发现hnRNPA2能够激活细胞核内应激相关基因的启动子。进一步研究揭示hnRNPA2能够通过在组蛋白上添加乙酰辅酶A 基团（乙酰化）开启基因的表达。组蛋白的乙酰化修饰能够帮助解开紧密包装的染色质，让转录过程进行得更加容易。除了激活应激相关基因维持生长和细胞永生，肿瘤细胞还会激活端粒酶确保细胞端粒始终处于合适长度。研究人员发现虽然在线粒体数目减少的细胞内端粒酶表达水平会出现增加，阻断hnRNPA2表达能够逆转这种情况。研究人员还进一步证实了这个蛋白如何作为乙酰转移酶发挥乙酰化作用，突变其中几个重要位点该蛋白的乙酰转移酶活性会大大受到影响。最后为了检验hnRNPA2与肿瘤进展之间的关联，研究人员发现虽然线粒体数目减少的细胞侵袭能力更强，但是表达突变hnRNPA2的细胞却缺少了这种能力。研究人员希望未来能够开发一些小分子阻断hnRNPA2的催化活性，看是否能够阻止癌细胞的侵袭和转移。

阳光为抗感染T细胞充能阳光能帮助我们合成维生素D，最近一项新研究发现晒太阳还能为我们带来另外一个好处。乔治城大学医学中心的研究人员发现阳光除了促进维生素D的合成，还能够为免疫系统中的T细胞的移动提供能量。相关研究结果发表在国际学术期刊Scientific Reports上。在这项研究中，研究人员发现光线中的低度蓝光能够让T细胞移动得更加迅速。“无论是辅助T细胞还是杀伤T 细胞都需要通过移动到达感染部位来发挥作用。这项研究表明阳光能够通过改变环境直接激活关键免疫细胞。”文章作者Gerard Ahern教授这样说道。他还补充道，虽然维生素D合成所需要得UV光线会促进皮肤癌以及黑色素瘤的发生，但是阳光以及其他特殊灯具发出的蓝光是安全的。人类皮肤中有许多T细胞，是血液中T细胞数目的大约两倍。“我们知道蓝光可以到达皮肤的真皮层，在光线刺激下皮肤中的T细胞可以进入更深的部位。”研究人员通过追踪光线激活的分子信号途径进一步研究了蓝光如何促进T细胞的移动。他们发现促进T细胞移动的动力来自过氧化氢的合成，过氧化氢随后激活了一条能够促进T细胞移动的信号途径。过氧化氢是一种由白细胞释放的化合物，当白细胞感知到感染为了杀死细菌或“呼叫”T细胞及其他免疫细胞发起免疫应答就会释放过氧化氢。“我们发现阳光能够导致T细胞合成过氧化氢，促进细胞移动。我们还知道在免疫应答过程中也会使用过氧化氢让T细胞移动到感染部位，这样就可以共同促进T细胞发挥作用。”Ahern这样表示。研究人员表示他们还有许多工作要做，如果蓝光激活T细胞只会产生有益的应答，那么为病人提供蓝光治疗来促进他们的免疫功能将会非常有意义。

手机新用途：检测细菌耐药性？—耐药细菌严重威胁着全球公共卫生，造成了越来越多的高死亡率疾病，如肺炎、腹泻和败血症等。对抗细菌耐药性的挑战之一是部分偏远地区由于缺乏设备和技术人员而无法检测细菌药物敏感性。为了解决这个问题，一个来自UCLA的团队开发了一种便宜而简便、可以自动检测细菌药物敏感性的手机附件，这项研究成果最近发表在《科学 报告》杂志上。“考虑到耐药菌导致许多一线抗生素失效，从而严重威胁全球公共卫生，这项技术是非常及时、非常重要的，”UCLA Herry Samueli工程和应用工程学院电气工程及生物工程系教授Aydogan Ozcan说道。“我们这种基于手机的新技术能够在广泛的区域进行实验室级别的检测，尤其是在资源匮乏的地区。”这个设备将手机与96孔板连接在一起，通过LED灯照亮样品，手机相机可以检测到不同浓度抗生素造成的光透过率的改变，这些照片发送到服务器进行抗生素敏感性自动检测，1min后结果会发送到手机。研究人员还在UCLA进行了临床测试，他们制作了加入17种抗生素的孔板检测了78个病人样品中的克雷伯氏肺炎菌（一种高度耐药的细菌）。结果显示这个设备的检测准确率达98.2%，已经达到FDA要求的实验室测试标准。他们使用可以抑制细菌生长的最低浓度抗生素去追踪细菌的耐药性，从而为临床医生提供细菌耐药性参数（对药物敏感还是耐受）：如果细菌对药物产生反应（生长受到抑制）则表明该药物可杀伤该细菌；如果没有反应，则表明该细菌耐受该药物，需要更换药物进行治疗。“这种移动检测器完全不需要训练有素的诊断医生进行敏感性检测，这消除了常规检测的障碍，因而有助于全球细菌耐药性的追踪。”Garner说道。Di Carlo补充道：“这项技术另外的优点就是可以快速检测药物存在下细菌的生长情况。这使得医生能够快速调整治疗药物和方案，也许会拯救更多生命。”

利用CRISPR鉴定出潜在的HIV治疗靶标在一项新的研究中，来自美国怀特海德研究所、拉根研究所和布罗德研究所的研究人员利用CRISPR-Cas9基因编辑技术鉴定出三个有望用于治疗HIV感染的新靶标。他们描述了如何利用CRISPR筛选HIV感染但不是细胞存活所必需的人基因的方法鉴定出5个基因---它们的三个在早前的利用RNA干扰（RNAi）的研究中并未被鉴定出。他们的方法也能够被用来鉴定出针对其他的病毒性病原体的治疗性靶标。相关研究结果于2016年12月19日在线发表在Nature Genetics期刊上，论文标题为“A genome-wide CRISPR screen identifies a restricted set of HIV host dependency factors”。论文通信作者为David M Sabatini、Eric S Lander、Nir Hacohen和Bruce D Walker。Sabatini观察到，“考虑之前发表的一些文献，我们吃惊地发现存在如此少的宿主因子是HIV感染所需的。”而且，Sabatini注意到“这种基于CRISPR的筛选方法的美妙之处在于它们产生明确的和可靠的结果”。论文共同第一作者Ryan J. Park博士说，“当前的抗HIV药物靶向病毒蛋白。因为HIV非常快速地发生突变，所以耐药性HIV毒株经常会出现，特别是当病人忘记服用他们的药物时。开发新的药物来靶向HIV感染所需的人基因同时使得耐药性产生的机会潜在地更少是一种大有希望的HIV治疗方法。”Walker解释道，“病毒是非常小的，具有非常少的基因---HIV仅有9个基因，而人有19,000多个基因---因此，病毒征用人基因来制造它们进行复制所必需的构成单元（building block）。我们的目标是鉴定出HIV进行复制所必需的但是能够被剔除而不会对病人造成伤害的人基因（也被称作宿主基因）”。论文共同第一作者Tim Wang解释道，“CRISPR使得在DNA水平上对基因进行完全敲除是可能实现的；我们的全基因组的基于CRISPR-Cas9的方法靶向18,500多个基因，它们中的绝大多数是人蛋白编码基因。我们的研究展现了基于CRISPR的筛选方法如何被用来鉴定出在其他的病毒性病原体存活中起着至关重要作用但是对宿主细胞活力是非必要的宿主因子。这种方法的广泛应用应当会查明一类新的潜在治疗性靶标，它们之前并未被探究用于传染病治疗中。”Hacohen补充道，“我们的研究的一个重要方面是重点关注人T细胞（一种免疫细胞），即HIV感染的主要靶标，和鉴定出在病毒对T细胞的感染中起着最为显著性作用的宿主基因。”之前的研究已鉴定出几种宿主依赖性因子，包括HIV侵入CD4阳性T细胞所需的两种蛋白：CD4分子本身，HIV就结合到这种分子上；CCR5，它促进常见的HIV毒株结合。携带特定CCR5突变的个人对这些病毒毒株产生免疫力---确实，唯一被认为治愈HIV感染的一个人就是接受来自携带这种CCR5突变的供者的骨髓移植。尽管治疗性CCR5抑制剂已被开发出，并且在临床上进行使用，但是它们能够造成严重的副作用。2008年的三项利用RNAi鉴定潜在的宿主依赖性因子的研究鉴定出800多种可能的靶标；但是这些研究结果之间很少存在重叠提示着存在较高的假阳性。此外，在这三项研究中，没有一项是利用HIV靶向的免疫细胞开展的，这也会降低鉴定出实际上参与HIV感染CD4阳性T细胞的基因的概率。Wang解释道，“RNAi抑制但不会完全阻断基因表达---这可能允许靶基因产生足够多的蛋白来允许HIV感染---而且它也能够抑制靶基因之外的其他基因表达，从而导致假阳性结果。”利用CRISPR对源自HIV敏感性的CD4阳性T细胞的一种细胞系进行筛选，研究人员鉴定出5个基因：当让它们失活时，会让细胞免受HIV感染，同时不会影响细胞存活。除了CD4和CCR5之外，这种筛选方法鉴定出编码两种酶的基因---TPST2和SLC35B2：它们对CCR5进行修饰以便HIV结合。另一个被鉴定出的基因是ALCAM，它参与细胞间粘附。当CD4阳性T细胞接触低水平HIV病毒时，正如在自然传播中可能观察到的那样，ALCAM缺失与显著地抵抗HIV感染相关联。Park解释道，“在我们的细胞系中，ALCAM是细胞间粘附所必需的，从而允许病毒更加高效地从一个细胞转移到下一个细胞。事实上，我们发现人工诱导缺乏ALCAM的细胞聚集会恢复HIV的细胞间传播。还需开展进一步的研究来探究靶向这些基因是否对人体是有毒性的。然而，即便系统性抑制会有毒性作用，仅在CD4阳性T细胞或它们的前体细胞中选择性地靶向这些基因可能会避免这些毒性，不过应注意到基因疗法仍然是一种充满挑战性的潜在高成本的治疗方法。”

利用冷冻技术死而复生？挑战很大但并非完全不可想象 一名死于癌症的女孩近日成为最新一位加入遗体冷冻行列的成员。这名少女也是英国首位在美国底特律人体冷冻机构接受遗体冷冻的英国儿童 目前这名女孩的遗体正被保存在美国底特律郊外人体冷冻研究所的低温液氮之中 接受处理的遗体会现在左侧这个放满冰块的容器内被流干所有血液，随后移到右侧容器内并在数周时间内逐渐降温到零下196摄氏度的低温就在这个月早些时候，一名英国的14岁女孩通过努力争取到了一项特殊的权利：在她死后，她的遗体将被深度冷冻保存。在她写给法院法官的一封信里，小女孩写道：“我想深度冷冻将给我一次机会被治愈并再次苏醒，即便那将是在数百年之后。”一位年纪轻轻就不幸因罹患癌症而去世的孩子成为了加入这一规模很小但人数正在不断增长的小团体中的最新一员，这些人都选择在死后将自己的遗体冷冻保存。他们希望等待未来医学技术的发展有朝一日将能够帮助治愈曾经置他们于死地的绝症并起死回生。但他们真的能等来这样一天吗？英国拉夫堡大学再生医学高级讲座教授亚历山大·斯托尔辛对该种技术的前景与风险做了分析。大自然已经证明，某些种类的动物，包括爬行动物，两栖类，蠕虫和昆虫是可以实现身体的低温冷冻并再次苏醒的。经过训练，能够识别某种特定气味信号的蠕虫在被冷冻并再次解冻苏醒之后仍然保留着对于这种特定气味的记忆。一种林蛙在冬天会被冰雪完全冻结，但到第二年春天，它们又能够重新活蹦乱跳，完全不受任何影响。但是实验也已经证明，人体组织经历冷冻-解冻过程将会造成严重损害。因此，理解这一过程并尝试将这种损害降低到最小程度就将是深度冷冻技术中最先需要解决的问题。在细胞层面上，我们对于这些由于冷冻-解冻造成的损伤仍然理解地非常肤浅，但这种损伤的确是可以被控制的。我们可以在两个方面持续努力：改进冷冻保存技术，以及不断优化解冻过程。在冷冻阶段，通过细致的温度调控，并配合各种不同的冷冻保护剂，机体的组织损伤是可以被控制的。但我们需要担心的还不仅仅是单个的细胞。在冷冻状态下，机体组织在生物学上基本上是出于稳定状态的。此时生物化学反应，包括降解过程，在低温环境下都被极大的减慢甚至终止了。然而在低温状态下，机体却可能遭受一些物理损伤，比如细如发丝的微小裂痕。还有，在解冻过程中，温度的细微变化也可能导致一系列的问题。除此之外，在整体表观遗传学方面也将产生影响——通俗的说，表观遗传学认为，环境因素和我们对于生活方式的选择将会影响我们的基因。然而，抗氧化剂和其他物质都能够帮助解冻后的恢复并防止损伤扩大化。另外，要想恢复整个身体，这件事本身又是一项巨大的挑战，因为整个人体的所有器官组织都必须同时启动恢复，人体才能复原。好消息是：在重启血液循环，从而向器官和组织供血这一方面，外科手术急救上的经验已经让我们掌握了一部分技术。还有，低温也并非只有坏处，在低温状态下，疾病导致的损伤是能够得到缓解和遏制的。溺水的受害者在被抢救生还时，医生们发现他们的身体似乎得到了低温水体的某种保护，这一发现引发了医学界对于在外科手术中使用低温方法保护机体的持续研究。低温生物学方面的前沿研究不仅有关医学，也有关经济学。细胞保存方面的很多技术进展都是由不孕不育和再生医学领域的需求所推动的。利用低温保存的细胞和单一组织器官，如卵子、精子、骨髓、干细胞、眼角膜、皮肤等等，在技术上早就已经实现了低温保存-解冻并用于手术移植。科学家们也已经着手研究利用低温技术保存人体的一些部分，比如手指或者脚。而一些复杂器官，如肾脏、肝脏、肠子等等也早已实现了低温保存和解冻移植。但手术移植目前所依赖的技术仍然是低温，而不是冷冻技术，两者之间还是存在不同。最大的技术障碍对于整个大脑的冷冻保存一直未有涉足，直到上世纪70年代开始才有一些实验的相关报道。尽管大脑保存有一些有利条件，比如比较好的供血条件以及对机械扭曲比较高的忍耐度，但也存在诸多特定的技术和科学方面的挑战，尤其是如何保存大脑原先的一些功能和记忆。除非出现重大技术突破，全人体冷冻保存和恢复在未来相当长的一段时间里都将难以被真正应用于治疗目的。但该技术领域还有另外一项重大问题：那就是我们对于这项技术的要求还不仅仅限于防止冷冻-解冻过程可能对机体产生的损伤，我们还必须修复和治好导致该名患者去世的疾病，从而让患者能够“起死回生”并恢复意识。从纯技术角度来说，这种情况简直是徒增麻烦，因而是应当避免的。举例来说，一名患有痴呆症的患者在他们去世时通常就已经丧失大部分记忆了，因此无论如何，当他们经由冷冻恢复技术再次苏醒时，也不可能恢复之前的记忆。面对此种情况，一些患有神经退化性疾病并且不希望在经由冷冻治疗之后醒来丧失全部记忆的患者，可能会选择在他们生前记忆尚未完全遗失时就被冷冻起来，这样未来当他们再次苏醒时或许还能保持一些“前世”的回忆。但这样做很显然会引发一些法律和伦理学问题。当然，退一万步讲，未来我们果真能够做到保存人的大脑并且使其毫发无损地恢复吗？正如前面所解释的那样，这一技术的成功将取决于冷冻保存技术的质量以及解冻技术的成熟。冷冻技术如果不成熟，那么冷冻过程对组织的损伤就会增加。这无疑就会引发关于如何进行相关损伤修复的话题，而这就将涉及纳米技术，而就在不久之前，纳米技术还被认为只存在于科幻小说之中。总的来说，纳米修复技术是设想有一天人类将能够设计出某种极小的人造分子机器，其能够在细胞和组织层面修复我们身体在冷冻过程中造成的所有损伤，从而让解冻复原和“起死回生”成为可能。鉴于该领域技术的突飞猛进，目前要断言说冷冻保存和复原技术完全是天方夜谭或许还为时尚早。 

十年研究，徐华强教授突破gpcr信号传导领域世界级难题 近日，2016药明康德生命化学研究奖评选结果新鲜出炉。中国科学院上海药物研究所研究员、中国科学院受体结构与功能重点实验室主任徐华强教授凭借受体结构与功能研究领域的累累硕果，摘得2016药明康德生命化学研究奖“杰出成就奖”。徐华强教授主要研究的领域是gpcr（g蛋白偶联受体）的结构与作用机制。在全球，这个充满魅力的研究领域正不断为医药业带来新的活力——至少有三分之一的小分子药物是gpcr的激活剂或者拮抗剂，还有更多这样的候选药物小分子在临床研发中。全世界多个顶尖实验室和企业都在这一领域竞相研发。在这个重要的领域，徐华强教授持续攻坚十年，取得了多项重大突破。他在gpcr结构方面的多项研究攻克了许多未解难题，被学术界誉为结构生物学研究领域的里程碑，轰动了国内外医学界与药学界。一个激动人心的药物研发领域2012年，罗伯特·莱夫科维茨（robert j. lefkowitz）和布莱恩·克比尔卡（brian k. kobilka）两位科学家因“g蛋白偶联受体研究”获得当年的诺贝尔化学奖。这一发现揭开了人体信息交流系统的许多秘密：我们的身体究竟是如何感知外部世界，并将这些信号“通知”到各个细胞。然而，gpcr信号通路的多样性和复杂性决定了这一诺奖成果的取得并不是一个领域研究的完结，而是意味着更多探索旅程的开始。在细胞通讯中，作为信号蛋白的arrestin与多种g蛋白都可以结合gpcr，以传递重要的指令，执行例如生长调控和激素分泌等众多基本生命过程。不过，g蛋白信号通路和arrestin信号通路在生理作用上截然不同。arrestin通过脱敏作用会阻止g蛋白的激活，并通过内化作用的过程将gpcr回收。长期以来，科学家们对于arrestin如何结合gpcr、如何激活不同组的细胞信号、以及这与g蛋白和gpcr互作之间的差别知之甚少。这极大地限制了许多潜在药物的研发。实际上，如果能靶向作用于其中一条信号通路，那么这样的gpcr抑制剂往往更可能成为理想的药物分子。相比非选择性的药物，它们能够带来更好的疗效和更少的不良副作用。然而，要想得到这样的小分子，就必需了解它们与gpcr之间的详细作用过程。小细胞大贡献，毫厘之间进化生命医学过去十年间，徐华强教授所领导的团队始终致力于揭示arrestin与 gpcr rhodopsin构成的复合物的结构。沉浸于探索分子世界的他们，终于在去年取得了突破性进展，将生命过程的一条路径展现给了世界。 ▲徐华强教授的发现攻克世界级的科学难题研究中，徐华强教授创造性地采用了“最亮”的x射线自由电子激光技术lcls（linac coherent light source，目前世界上最强的x射线自由电子激光器，能够以比以往x-射线源强10亿倍的亮度发射x-射线脉冲），生成了与gpcr结合arrestin时的首个三维图像。这一发现攻克了细胞信号传导领域的世界级科学难题，也为开发选择性更高的药物奠定了理论基础，使开发出副作用更小、更有效的心脏病、神经退行性疾病和癌症等疾病疗法成为可能。徐华强教授表示：“在药物发现领域，对药物靶点蛋白的结构与功能关系理解越深，开发出高效低毒药物的几率就越大。”去年这一里程碑成果一经发布在《自然》期刊上后，马上在生物医学界引起热议，该新闻还入选了2015年中国十大科技进展新闻，并于今年3月再获国际蛋白质学会（the protein society）颁发的hans neurath奖。国际蛋白质学会执行委员会的成员查尔斯·桑德斯博士评论道：“此项研究是结构生物学研究领域的里程碑，为众多基础生物学研究及生物医学发展提供了广泛而深入的见解，这项工作非常优秀。”科研狂人：成功就是99%的努力工作“从事科学研究，一是对科学的兴趣，尤其对生命科学的各种奥秘感兴趣；二是贵在坚持，科学研究是探索，长年的工作才有一点点突破，就是最大的欣慰；三是在于努力，科学研究的成功就是99%的努力工作，再加上1%的运气，”徐华强教授曾这样说道。在研究方面，徐华强所带领的团队可以说是硕果累累，已在《自然》、《科学》、《science signaling》、《jounal of biological chemistry》、《proceedings of the national academy of sciences》等国际著名学术期刊发表论文百余篇，获得专利十余项。在科研的道路上，教授从未停歇。同事都说，他是个”科研狂人”。自1980年在清华大学开始接触核子物理科学后，徐教授就一直沉浸在科研当中。从国内到国外，再从国外辗转回到国内，始终不变的是他对生命科学奥秘的探索和追求。在中国科学院上海药物研究所，他还先后创建了药物靶标结构与功能中心和受体结构与功能重点实验室，主要从事核激素受体、肝细胞生长因子(hgf)受体、g蛋白偶联受体(gpcr)、离子通道和植物激素受体等结构与功能领域研究，开展基于晶体结构的肿瘤与糖尿病的药物研发，并取得了多项原创性发现。一直以来，他研究的是生命科学。他尊重生命，懂得生命的意义。医生一次只能治疗一个患者，而基础研究成果却可能拯救无数人的生命、无数代人的生命。这也是为什么在科研这条道路上，他从不停歇、从不松懈。

ELISA试剂盒测定中有的三个必要试剂ELISA试剂盒滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型成为有色的氧化型，ELISA查看试剂盒呈现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来断定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。实际上每一测定体系应该用实验求出各自的S/N的阈值。更应留神的是，N所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。现在主要有两种类型的封闭液：蛋白和非离子型去污剂。您运用的类型须取决于多个要素，包括微孔板的表面ELISA查看试剂盒、吸附的抗原、您的抗体和查看试剂。好的封闭液应降低非特异性联络，但它不应当与抗原、抗体或查看试剂发生彼此作用。最常用的非离子型去污剂是Tween-20。这种封闭液便宜、安稳，在去掉洗刷过程中的一些非特异联络上很有用。ELISA试剂盒测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸剂"（immunosorbent）；（2）酶符号的抗原或抗体，称为“酶联物"、“联络物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来历和标本的情况以及查看的具体条件，可规划出各种不同类型的查看方法。ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所致使的盛行症、ELISA查看试剂盒寄生虫病及非盛行症等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据现已运用的效果，以为ELISA试剂盒法具有活络、特异、简略、敏捷、安稳及易于自动化操作等特色。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液，致使反应后发生的本底或许较正常人血清的本底低得多。ELISA试剂盒在实验条件（包括试剂）较难保证安稳的情况下，这种差异法较为合适。

ELISA实验需要注意温育问题ELISA实验中影响测定成败最为关键的一个因素,那就是温育。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，如果要让液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，需要在一定的温度条件下反应一定的时间。在使用Elisa试剂盒进行实验时，需要注意温育问题。    温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。     一些操作者，擅自改变说明书操作，使用自己喜欢的温育时间和温育温度，这样造成一些不必要的麻烦。因为，不同试剂盒有不同的温育时间和温育温度的选择，随意更改温育时间或者温育温度将导致试验结果出现偏差。 保温方式:    ELISA仪器附有特制的电热块，水浴。    若用保温箱:    ELISA板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。        室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。

白介素使用后的不良反应表现关于人白介素我们之前已经有过一次接触了，不知道大家是否还有影响呢?今天小编要继续跟大家讲解人白介素的其他知识。那就是使用了本产品之后出现的一些不良反应都有哪些表现，希望大家都能够谨记本文内容，因为药品出现不良反应或者过敏等情况严重的话，甚至有性命之忧。　　人白介素不良反应表现：　　第一、各种不良反应中最常见的是发热、寒战，而且与用药剂量有关，一般是一过性发热38℃左右，亦可有寒战高热，停药后3～4小时体温多可自行恢复到正常。　　第二、个别患者可出现恶心、呕吐、类感冒症状。皮下注射者局部可出现红肿、硬结、疼痛，所有副反应停药后均可自行恢复。　　第三、使用较大剂量时，本品可能会引起毛细血管渗漏综合征，表现为低血压、末梢水肿、暂时性肾功能不全等。使用本品应严格掌握安全剂量，出现上述反应可对症治疗。　　这些不良反应的表现都是本公司多年来的经验总结，若是使用本药品之后出现这类反应一定要及时就医，不能懈怠。另外提醒大家一点就是人白介素必须要在医生的指导下才能使用，不可按自己意愿想怎么用就怎么用，要是这样做只会给自己带来危害。

细胞培养升级篇--血清1. 保存血清最好的方法?建议血清应保存在-5℃至-2O℃。然而，若存放于4℃时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。2. 如何解冻血清才不会使产品质量受损?建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。3. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。4. 为什么要热灭活血清?加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。5. 有必要做热灭活吗?实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。6. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?GIBICO的胎牛血清没有预老化，储存在2-8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。7. 如何避免沉淀物的产生?解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

细胞培养升级篇---细胞分离试剂1. 大部分连续细胞系，强贴壁细胞系，许多早代细胞HBSS或无钙镁PBS0.25％胰蛋白酶溶解在无钙镁平衡盐溶液中2. 细胞表面蛋白完整性重要的连续细胞系HBSS或无钙镁PBS0.05％胰蛋白酶溶解在0.53mM EDTA3. 弱贴壁表皮细胞转化成纤维细胞（要求细胞表面完整性），原代细胞HBSS或无钙镁PBSEDTA,甘油 溶解在柠檬酸钠中4. 强贴壁早代细胞系HBSS或无钙镁PBS0.25％胰蛋白酶溶解在1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4单位/ml 溶解在PBS5. 上皮细胞0.5mM -1mM EDTA0.5mM -1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4单位/ml 溶解在PBS6. 强贴壁细胞，上皮细胞，一些肿瘤细胞0.5mM -1mM EDTA0.25％胰蛋白酶1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4单位/ml 溶解在无钙镁PBS7. 厚培养物，多层富含胶原的密集培养1mM EDTA0.25％胰蛋白酶，200单位/ml胶原酶，1mM EDTA溶解在无钙镁平衡盐溶液中

ELISA中常见问题及解决方法ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。我将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。下面分析Elisa试验操作中可能影响结果的原因，并给出相应的解决办法1 选择试剂 选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。 2 加样 可能原因： 1）血清或血浆标本分离不好即进行加样； 2）手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)； 3）加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。 解决办法： 1） 标本为血清：最好将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。 2) 加样后及时放入孵箱。 3) 加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。 4) 如果采用AT或其他全自动加样，最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。 5) 标本较多时，请分批操作。 3 孵育 可能原因： 1) 孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底； 2) 孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。 解决办法： 1) 贴封片或加盖； 2) 按说明步骤严格控制操作时间。4 洗板 可能原因： 1) 采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。 2) 采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。 3) 反应板过多造成洗板等待时间长。 解决办法： 1) 保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干； 2) 合理安排，或多用几台洗板机。5 显色 可能原因： 1) 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂； 2) 加显色剂时溅出孔外造成液体回流。 解决办法： 1) 显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用； 2) 加样时保持显色剂不外流； 3) A、B液应避免接触金属器械。 6 终止 可能原因如加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。所以在加终止液时应避免产生气泡。 7 读板 如读板时板底不清洁等。应保证酶标板清洁。所以在整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸; 尽可能实现ELISA检测标准自动化，有效提高检测质量。在实际操作中，除了选择优良试剂外，必须严格按照操作步骤进行操作，同时作好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每一份标本，才能保证检测质量。现在国内已有相当数量的单位拥有全自动酶标仪，这对于实现ELISA标准化检测、提高检测质量起到了重要作用。

酶联免疫吸附测定（ELISA）操作要点标本的采取和保存 可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。 血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。 2 试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 3 加样 在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。 4 保温 在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。 ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。 温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。 5 洗涤 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。 洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种，过程如下：（1）浸泡式 a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。 微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。 （2）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗2分钟后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡2分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。 6 显色和比色 （1） 显色 显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判断。 OPD底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。 TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。（2） 比色 比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验，需先将板置于标准96孔的座架中，才可进行比色。最好在加底物液显色前，先将软板边缘剪净，这样，此板就可完全平妥坐入座架中。 比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。 比色结果的表达以往通用光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。 （3） 酶标比色仪 酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。举例说，若某孔测得的A值为1.083，则该孔相对于空气的真实A值应为1.083±0.01(1.073~1.093），重复测定数次，其A值均应1.083±0.05（1.078~1.088）在之间。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标仪在0.000~2.000，新型号的酶标仪上限拓宽达2.900，甚至更高。超出可测上限的A值常以"*"或"over"或其它符号表示。应注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常小于可测范围，比如某一酶标仪的可测范围为0.000~2.900，而其线性范围仅0.000~2.000，这在定量ELISA中制作标准曲线时应予注意。 酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30℃，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。 测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不移动ELISA板的位置。例如OPD用492nm为W1，630nm为W2，最终测得的A值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。 各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细新闻记者说明书。 7 结果判断 定性测定 定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出"有"或"无"的简单回答，分别用"阳性"、"阴性"表示。"阳性"表示该标本在该测定系统中有反应。"阴性"则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。 在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。 （1） 间接法和夹心法 这类反应的定性结果可以用肉眼判断。目视标本也无色或近于无色者判为阴性，显色清晰者为阳性。但在ELSIA中，正常人血清反应后常可出现呈色的本底，此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而异，因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物（见3.6）。在用肉眼判断结果时，更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。目视法简捷明了，但颇具主观性。在条件许可下，应该用比色计测定吸光值，这样可以得到客观的数据。先读出标本（sample，S）、阳性对照（P）、和阴性对照（N）的吸光值，然后进行计算。计算方法有多种，大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类。a． 阳性判定值 阳性判定值（cut-off value）一般为阴性对照A值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。 用此法判断结果要求实验条件十分恒定，试剂的制备必须标准化，阳性和阴性的对照品应符合一定的规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。现举某种检测HBsAg的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为不含HBsAg的复钙人血浆，阳性对照品HBsAg的含量标明为P=9±2ng/ml。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后，先计算阴性对照A值的平均数（NCX）和阳性对照A值的平均数（PCX），两个平均数的差（P-N）必须大于一个特定的数值（例0.400），试验才有效。3个阴性对照A值均应≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而已另两个阴性对照重新计算NCX；如有两个阴性对照A值超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算： 阳性判定值=NCX+0.05 标本A值＞阳性判定值的为阳性，小于阳性判定值的为阴性。应注意的是，式中0.05为该试剂盒的常数，只适合于该特定条件下，而不是对各种试剂均可通用。 根据以上叙述可以看出，在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到试验的质控作用，试剂变质和操作不当均会产生"试验无效"的后果。 b.标本/阴性对照比值 在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（S）和阴性对照（N）的A值后，计算S/N值。也有写作P/N的，这里的P不代表阳性(positive)，而是病人（patient）的缩写，不应误解。为避免混淆，更宜用S/N表示。在早期的间接法ELISA中，有些作者定出S/N为阳性标准，现多为各种测定所沿用。实际上每一测定系统应该用实验求出各自的S/N的阈值。更应注意的是，N所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液，以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此，这类试剂盒规，如N<0.05（或其他数值），则按0.05计算，否则将出现假阳性结果。 （2）竞争法 在竞争法ELISA中，阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入竞争抑制物的量，一般调节阴性对照的吸光度在1.0-1.5之间，此时反应最为敏感。 竞争法ELISA不易用自视判断结果，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出S、P和N的吸光值。计算方法主要也有两种，即阳性判定值法和抑制率法。 a. 阳性判定值法 与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同，但在计算公式中引入阳性对照A值，现举某种检测抗HBc的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗HBc的复钙人血浆，阳性对照中抗HBc含量为125±100u/ml。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后，先计算阴性对照A值的平均值（NCX）和阳性对照A值的平均数（PCX），两个平均数的差（N-P）必须大于一个特定的数值（例如0.300）,试验才有效。3个阴性对照A值均应小于2.000，而且应≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而以另2个阴性对照重新计算×NCX；如有2个阴性对照A超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算： 阴性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX 标本A值≤阳性判定值的反应为阳性，A＞阳性判定值的反应为阴性。 b. 抑制率法 抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度，按下式计算： 抑制率（%）= （阴性对照A值-标本A值）×100%/阴性对照A值 一般规定抑制率≥50%为阳性，＜50%为阴性。 定量测定 ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域

免疫组化技术规范  欧美国家相继开展了免疫组化质量控制工作，建立了一套比较完善的质量控制方法和程序。中国病理工作者委员会（CCP）免疫组化研究中心借鉴国外的先进经验并结合我国当前的实际情况开始探索一种适合我国免疫组化质控的方法，同时，发现和推广标准化的染色程序，改善和提高免疫组化实验的可靠性，使免疫组化技术更具标准化，免疫组化结果更具可靠性和重复性。尽管免疫组化在许多实验室中已常规开展，但它是一个多步骤、多因素决定的一种实验方法，由于各实验室采用的修复方法、染色方法、试剂厂家、抗体克隆号、检测系统等有所不同，染色结果会出现较大差异，相当部分的实验室对免疫组化标准化的认识尚欠足够重视, 致使不良的染色结果对病理诊断引起误导，因此免疫组化染色结果的可靠性受到了极大的关注。    在实际工作当中有许多因素影响着免疫组化的结果，包括技术人员是否熟练掌握整个实验的操作程序、抗体的特异性、方法的敏感性、标本的固定、组织的处理、是否进行抗原修复、修复液的PH值等等因素。为了让每个实验室能够持续稳定地完成可靠的实验染色结果，应当将免疫组化染色技术中的全部流程纳入标准化。    一、 免疫组化成功的要素   病理科医生要有相当的免疫组化诊断知识和免疫组化技术经验，要清楚认识免疫组化技术是一门实验性、技术性非常强的技术，要多了解多种抗体在组织中的表达情况，以及影响免疫组化结果的各种因素，只有提高医生的免疫组化诊断水平才能避免错误的判断，才能确保免疫组化诊断的准确性。病理技术人员是免疫组化实验成功的关键因素，操作人员要有丰富的免疫组化的理论知识及熟练的免疫组化染色技术，十分清楚每一个步骤的应用原理，使实验结果更具可靠性。可靠的实验试剂和实验方法是每个实验室的必备条件。由于实验方法多种多样，抗体的品种繁多，每个实验室都应当确保高质量高效价的试剂，并摸索出最佳的实验条件。优质的免疫组化取决于有效的抗原修复、敏感的检测系统、合适的实验质控对照及熟练和有责任心的技术人员。    二、免疫组化染色前处理技术操作规范   1．取材：理想的取材厚度是0.2cm～0.3cm，大多数实验室都认为组织在加热抗原修复过程中造成脱片的主要原因是取材过厚或脱水浸蜡处理不当所致。良好的取材、固定、脱水过程是免疫组化质控的前提，如果H&E切片都做不出满意的染色结果，那么免疫组化染色也将无从谈起，根本无法保证染色质量。   2．固定：在众多的组织固定液中（如甲醛、乙醇、戊二醛、多聚甲醛 等），不同的实验方法在使用上各有千秋。但在保持组织细胞结构的完整性、抗原可测定性、组织渗透性以及试剂的价格上，福尔马林是最好、既经济又通用。而含酸或含汞的固定液对抗原保存均不理想。组织离体后固定一般不要超过30分钟，在常温条件下固定时间为8-24小时。同时还要注意避免福尔马林过度固定造成的组织抗原丢失，有研究发现新鲜组织经过福尔马林一周固定后组织抗原丢失严重，抗原几乎不能被检测，因为组织固定后会引起蛋白或蛋白分子之间形成交联，导致抗原位点遮盖，可以通过抗原修复方法来修正，若加抗体前不采用抗原修复，则免疫组化染色常不能到达理想结果或不成功。组织同样不能长时间放置在70%的乙醇中，酒精固定后的组织形态不如福尔马林固定的组织。脱钙液对抗原破坏较为严重，因此在组织脱钙前最好在福尔马林液中固定48小时，若组织没有固定透则酸会破坏抗原，脱钙液中酸的浓度与脱钙时间都必须尽量控制在最低的限度。   3．浸蜡：我们认为浸蜡温度应控制在58～60℃左右，浸蜡用的石蜡应经常更换，以减少石蜡中二甲苯的含量。高温下的二甲苯容易使组织发脆，细胞收缩，更容易掉片。   4．切片厚度：用于免疫组织化学染色的切片厚度为3-4微米。为防止在染色过程中脱片，需要使用硅化玻片裱片。   5．硅化玻片的制备：载玻片经酸洗冲洗干净后烤干； 2%APES丙酮或无水酒精中浸泡1～2min；丙酮或无水酒精洗1～2分钟；蒸馏水浸洗1～2min；烤干备用。   6．烤片：切片在60℃～65℃烤箱中烤片30－60分钟左右。有些实验室采用烤片过夜。有报导烤片温度超过60℃时，烤片时间超过18小时的切片，免疫组化染色强度比烤4小时的切片要略弱。温度过高或时间过长均会影响抗原的活性，原因是在高温干燥条件下可以加速组织切片中抗原的氧化。   7．切片保存：一些实验室研究人员习惯将组织蜡块连续切片后长期保存在室温条件下，切片后的组织在室温下长期保存抗原可以损失。迈新实验室在实验中发现蜡块切片后，在室温下保存三个月以上，免疫组化染色结果会出现减弱或阴性情况。并进行了新、旧切片的保存时间对照实验，选择11种不同组织蜡块每例连续切片10片，共110片，常温空气中放置一个月、三个月、半年、一年与新切片进行成对对照实验。实验结果表明：组织蜡块切片后在室温下保存三个月，抗原对多数抗体的敏感性约下降一半，部分切片丢失更多。切片保存半年多数的抗体不能出现阳性标记结果，保存一年以上仅有个别的切片能够有微弱的阳性表达，尤其核表达的抗原丢失更为突出。国外也有类似的资料报道。其原因可能与空气中的氧化作用有关，所以在实际工作可以采用蜡封切片来避免抗原损失以便长期保存，也可4℃冰箱冷藏保存，尤其是用于科研集中实验的切片更应注意切片的保存。   8．脱蜡：免疫组化的脱蜡步骤与常规H&E脱蜡步骤相同，免疫组化实验室中脱蜡需与H&E常规脱蜡分离，以保证脱蜡彻底，否则可能导致染色结果的异常。    三、免疫组化实验中的抗原修复   1．酶消化：如胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白水解酶   2．抗原热修复：高压法、微波法、水煮法众所周知，免疫组化染色中最关键的莫过于抗原修复，而绝大多数常用抗体的修复是通过加热来完成的，热抗原修复优于酶消化，更有效，染色结果更易一致，操作单一。   3．修复时间：既要获得最强的染色结果，又要保持组织形态的完整性。许多抗原修复存在的问题是组织固定时间过短时，强烈的抗原修复可引起形态破坏、脱片及组织完全消化，解决的方法可采用较短时间的热修复或减少酶的消化时间。   4．抗原修复缓冲液：有柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）、 Tris (pH7-8)、EDTA(pH8.0～9.0) 、 EGTA(pH9.0) 等，柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）的优点是染色背景清晰，适合于大多数抗体，Tris和 EDTA两种修复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同时加深，如使用不当易造成假阳性结果的判断。目前还没有一种抗原修复液能适合于所有的抗体，柠檬酸缓冲液（pH6.0）可作为免疫组化常规使用的抗原修复缓冲液，但也不能除外某些抗体适用于EDTA和EGTA缓冲修复液，一般抗原比较难于表达的抗体多选择高pH值的修复液。例如：ER、PR、Bcl-2、Bcl-6、TdT、Ki-67、Cyclin D1等。   5．抗原热修复注意事项：无论哪一步都不要让切片干凅，加热后需要冷却15－30分钟。充分的抗原修复是影响染色结果的唯一重要因素，加热的温度和时间可导致修复不足或过度修复。   6．抗原热修复对组织中内源性生物素的影响：抗原热修复在增强抗原决定簇表达的同时，也增强了组织中内源性生物素的反应。采用卵白素-生物素（Avidin-biotin）检测系统，组织中内源性生物素容易出现人为假象，在加热抗原处理条件完全相同的阴性对照片中可以观察到较强的内源性生物素的反应，没有经过热抗原处理的切片中没有出现类似的情况。在细胞浆中呈均一的细颗粒状的浅棕色阳性，有时表达也非常强，与真阳性的结果表达很相似，在以往的免疫组化染色中内源性生物素的影响对诊断造成许多的误差，却常常被忽略。值得提醒的是在概念上一定要十分清楚，阴性对照片必须与一抗的抗原修复处理条件完全相同，才能准确发现内源性生物素出现的部位。   7．内源性生物素封闭方法：一般在抗原修复以后，加抗体前使用卵白素进行生物素阻断处理，也可使用非生物素的检测系统，如：EliVision、EnVision、SuperVesion等。    四、免疫组化染色实验操作规范   1．脱蜡：二甲苯 ――→ 酒精 ――→ 蒸馏水   3．血清封闭：在加入一抗前需用二抗的正常血清进行封闭，可以减少非特异性结合。目前使用的二步法检测系统可以免去这一步骤。   4．抗体使用：已有大量的即用型抗体供实验室使用，厂家已进行过多次的实验检测，可按厂家提供的条件进行操作。浓缩型抗体一般按照厂家提供的建议稀释度，进行对倍稀释预实验。选定最佳的稀释滴度后再进行批量实验。染色背景深大多是抗体浓度过高所致。抗体孵育温度一般以常温25℃为基准或37℃30分钟，也可4℃冰箱过夜。   5．冲洗：常用的冲洗液为PBS或TBS缓冲液，要严格执行冲洗步骤，防止因冲洗不净引起的背景着色，缓冲液中加入Tween20可以增强冲洗效果。   6．检测系统：通用的检测系统有生物素标记的ABC、SP、LSAB等，此类检测系统较为经济，日前仍有不少医院在使用。非生物素类检测系统价钱较贵，由于不需通过生物素的结合，可以避免内源性生物素的干扰，其特点：敏感、省时、方便、背景低。   7．显色系统：由于检测系统采用的是辣根过氧化物酶，因此选择DAB（棕色）和AEC（红色）作为酶的底物，若采用碱性磷酸酶系统则选择BCIP/NBT（蓝紫色）,常规免疫组化显色首选的仍然是DAB，定位清晰，易于保存。AEC不能耐受酒精及敏感性低，BCIP/NBT阳性虽鲜艳，但阳性定位不准确。   8．复染：衬染步骤十分简单，但衬染的好坏对染色最终结果的质量影响很大。有的选用Harris苏木素，有的用Mayer’s苏木素，且与DAB染色对照效果最好，在绝大多数实验室中使用简单方便。也有实验室使用甲基绿衬染衬染，但不能经有机溶剂，容易退色。    五、染色结果的观察   1．阳性结果应定位在细胞相应的部位，在细胞膜表达的抗原阳性结果应定位在细胞膜上，在其他部位的阳性反应均为非特异性染色。不当的抗原修复会导致抗原在组织细胞中定位的改变。根据所检测抗原的不同，抗原分别定位在：（1）细胞膜：如LCA和CD3、CD20等；（2）细胞质：如Cytokeratin 、GFAP、S100 、CgA、AFP等；（3）细胞核：如Ki-67、ER、PR、TTF-1、HPV-Ag、Cyclin D1、TDT等。   2．组织的周边、气泡、刀痕、皱折等部位往往呈现非特异性阳性表达。   3．染色结果呈阴性并非都是抗原不表达，要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关。   4．组织切片背景深与下列因素有关：（1）石蜡切片脱蜡不干净；（2）第一抗体浓度过高或孵育时间过长，温度过高；（3）显色剂DAB浓度过高或H2O2太多；（4）抗体不纯；（5）抗体孵育后切片清洗不干净。    六、免疫组化实验对照   为证实抗体和检测试剂盒效价是否可靠，染色操作是否正确，一般需要进行实验对照，以避免试剂失效或操作失当而出现假阴性和假阳性，确保染色结果的可靠性。   1．阳性对照:选用已知染色中度阳性以上的组织切片染色，阳性切片应呈阳性，此外组织中的内对照也是很好的阳性对照。   2．阴性对照:选用已知染色阴性的组织切片染色，其结果应为阴性。每次实验中增加Vimentin染色作为对照，目的是观察组织经福尔马林固定后预期抗原表达的敏感性，按福尔马林固定后抗原损伤的程度来进行分析。Vimentin几乎在任何组织中都有表达，尤其适合活检组织中的免疫组化染色观察。在与上皮组织相连接的间质中存在着大量的血管Vimentin可阳性表达，如果在同一张切片的间质中出现Vimentin染色微弱或部分区域变弱的情况，表明是不当的固定导致抗原破坏。所以在每批次实验中应常规加入Vimentin染色，用于指导观察福尔马林固定后抗原表达敏感性情况。    七、抗体的保存和稀释   一般来说，抗体应放在4℃冰箱中保存，第一抗体可分成小包装于-20℃保存，使用时存放在4℃，不宜反复存放于4℃和-20℃之间，反复冻融会使抗体效价下跌。检测系统一般不宜于-20℃保存，因为反复冻融使得与抗体结合的酶容易分解，导致检测的敏感度降低。浓缩的抗体在染色前应根据说明书要求或自行摸索出的最佳工作浓度进行稀释。可将抗体稀释至1：10，染色前再稀释成工作液。浓缩液抗体保存的时间较长，反之稀释后的抗体保存的期限较短，如使用即用型抗体，经过一定时间后应注意其效价时否有所降低，避免出现假阴性染色。   Nestin、PDGFR 可用于胃肠间质瘤的诊断指标，尤其对CD117阴性胃肠间质瘤在诊断上有很大的帮助，在国外已有文献报导。这两种抗体可用于常规固定的石蜡切片，经实验证明Nestin 用PH8.0 EDTA高压修复，PDGFR用PH6.0 柠檬酸微波修复效果较好。

ELISA初步探讨的分类和发展    1971年瑞典的Engvall等人分别以纤维素和聚苯乙烯试管作为固相载体吸附抗原/抗体，建立了酶联免疫吸附测（Enzyme Linked Immunosrbent Assay,简称ELISA），后来人们改用板式反应孔进行ELISA，大大地提高了实验通量。ELISA实验具有极高的灵活性，实际操作中人们可以根据自己的需要以及手上已有的材料进行灵活的组合而进行各种可样的ELISA进行反应测定，另外ELISA实验中的相关试剂和耗材都已经商品化，所以ELISA被广泛地应用于生物学的各种研究中。通过ScienceDirect搜索可以看出，1975年只有1篇文献是研究ELISA的，1976年为6篇，但是到2010年这一数字上升到1994篇，历年文献累计达29490篇，足见其研究之广。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA的种类及原理    关于ELISA的分类众说纷纭，不同文献从原理或操作上都有不同的分类意见。这里先将ELISA分为以下四大类，然后针对每一类进行详细讲解：(1)直接ELISA；（2）间接ELISA；（3）夹心ELISA；（4）竞争抑制ELISA。其它的ELISA都隶属于这四类ELISA或由这四类ELISA组合衍生。 【直接ELISA】    直接ELISA是所有ELISA中步骤最简单的一种，其方法是将抗原按一定的比例用包被缓冲液稀释好包被到固相载体上，包被完成后简单洗涤，再加入封闭液，封闭结束后再次洗涤除去多余封闭液，加入稀释好的特异性的酶标抗体，37℃温育一小时或4℃温育过夜后，洗涤除去多余的抗体，加入底物显色并判读结果。最后显色的深浅与加入的酶标抗体量成正比。直接ELISA的原理如图1： 图1直接ELISA原理     一个很常见的直接ELISA实例就是检测单抗亚型，实际操作中可以将经过亲和纯化的单抗包被在酶标板上，封闭后加入酶标分型二抗，最后加底物显色即可。此外用直接ELISA可以检测血清种属，也有人用直接ELISA进行单克隆抗体制备中的初步筛选。不过虽然直接ELISA操作很简单，步骤也比较简练，但是其应用范围还是非常有限的，一个重要的原因是这种ELISA中只经过了一步信号放大（酶的放大），所以其灵敏度不是很高，另外其测定的对象也非常有限，只能测定酶标记的分子。 【间接ELISA】    间接ELISA的步骤与直接ELISA步骤前面的部分基本一致，不同的是，间接ELISA中与包被好的抗原结合的不是酶标抗体，而是非酶标的，另外再引入第二种抗体（即二抗），二抗是经过酶标的，它可以与第一种抗体（与抗原直接结合的抗体，即一抗）特异性结合。最后加入底物显色并判读结果。当二抗的浓度一定的时候，最终的显色结果与一抗的量是正相关的。间接ELISA的操作如图2，同直接ELISA将抗原包被到酶标板上，洗涤后封闭，再次洗涤后加入稀释好的待检抗体（一抗），温育后洗掉未与抗原结合的一抗，再加入酶标二抗，再次温育，此时酶标二抗即可与一抗结合，最后加入底物显色。     由于二抗一般为多抗，因此一个一抗分子上可以结合多个二抗分子，同时一个二抗分子上可以标记上多个酶分子，所以当待测抗体为多抗时（可以由多个一抗分子与抗原结合），信号经过两步放大，最终提高了检测的灵敏度。另外由于二抗制备比较容易，而且很早就开始商品化，所以操作者无需要将一抗进行酶标，大大缩减了工作量。在检测抗体的效价、血清的效价以及单克隆抗体的筛选过程中，间接ELISA都是非常重要的实验过程，在临床诊断中，间接ELISA也是检测标志性抗体的重要手段。 图2间接ELISA原理 【夹心ELISA】    夹心ELISA（Sandwich ELISA）总体上可以分为两种：直接夹心ELISA和间接夹心ELISA。直接夹心ELISA又分为双抗夹心ELISA和双抗原夹心ELISA。双抗夹心ELISA的方法是：将第一种抗体（捕获抗体）包被在固相载体上，封闭后加入待检抗原，温育后加入第二种抗体（检测抗体），捕获抗体和检测抗体可以是针对不同表位的两种单抗，也可以是针对同一抗原的一种单抗与一种多抗，但是检测抗体需要经过酶标。双抗原夹心ELISA的原理和操作与双抗夹心基本相同，不同的是包被的是抗原，待检对象是抗体，然后加入酶标抗原，再加底物显色。直接夹心ELISA的原理如图3。图3直接夹心ELISA原理     对于双抗夹心ELISA，待检对象必须包括两个或者两个以上的表位，否则检测抗体无法与待检抗原结合，例如半抗原和小分子抗原都是不能用双抗夹心ELISA检测的。对于双抗原夹心ELISA，其操作与间接ELISA基本相同，但利用特异性的抗原代替酶标二抗，所以特异性比间接法更好。另外，由于间接ELISA中使用的二抗一般只能识别IgG，而双抗原夹心ELISA中任何类似的免疫球蛋白都可以被检测出，因此双抗原夹心ELISA比间接ELISA也更灵敏。     下面我将结合一些试剂盒举例说明加拿大(ANOGEN) human interleukin-8(IL-8),这个指标试剂盒的用到的系统就是这种直接夹心ELISA,在此基础上发展了亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)，以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原），加拿大(ANOGEN) human interleukin-1β(IL-1β)，TNF-α，IL-6 均用到此体系。     间接夹心ELISA是基于两种不同种属来源的抗体的夹心ELISA，其原理是将一种种属来源的特异性抗体包被于固相载体上（作为捕获抗体），封闭，加入待检抗原，温育，洗涤后加入另一种种属来源的特异性抗体（非酶标，作为检测抗体），最后加入酶标二抗（特异性识别检测抗体），再加底物显色。间接夹心ELISA的原理如图4。与直接双抗夹心ELISA相比，间接夹心ELISA中引入了特异性识别检测抗体的酶标二抗，相当于整个体系的信号增加了一步放大系统，于是最终的结果比直接双抗夹心ELISA更灵敏。同时，由于间接夹心ELISA中的酶标二抗仅能识别检测抗体，而不能识别捕获抗体，所以体系的特异性也得到了保障。值得提出的是，间接夹心ELISA并不是严格要求捕获抗体与检测抗体来源于同一物种，也可以是这种情形：仅用特异性的抗体的Fab片段包被固相载体作为捕获抗体，而用未经处理的同种属来源的特异性抗体作为检测抗体，酶标二抗选用只针对检测抗体的Fc段的二抗，这样的酶标二抗同样不能识别捕获抗体，从而使这种体系里的捕获抗体与检测抗体起到类似于不同种属来源的效果。间接夹心ELISA涉及的体系比较复杂，用到的试剂也比其它的ELISA复杂，但是其检测灵敏度上的优越性使它在检测那些低丰度抗原的样品中应用得十分广泛。 图4间接夹心ELISA 【竞争抑制ELISA】    竞争抑制ELISA又叫封闭ELISA，其主要原理是用待检抗原或抗体去干扰已经预先设计好的体系，最终显色的结果与待检抗原或抗体的干扰程度成负相关。竞争抑制ELISA灵活性很强，可以在此基础上设计出更复杂的实验方案，从而派生出所谓的直接竞争抑制ELISA、间接竞争抑制ELISA、夹心竞争ELISA等特殊的ELISA方法。这里仅以直接竞争抑制ELISA和间接竞争抑制ELISA为例简单阐述原理。直接竞争抑制ELISA中，预先将抗原包被在固相载体上，并加入酶标的特异性抗体。实验时，加入待检抗原（或抗体），如果待检对象是抗原，则待检抗原就与预先包被在固相载体上的抗原竞争结构酶标抗体；如果待检测对象是抗体，则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被在固相载体上的抗原。洗涤过程就可以洗掉被竞争下的酶标抗体，最后加底物显色。最终显色的结果与待检原（或抗体）量成反比。直接竞争抑制ELISA的原理如图5。注意在直接竞争抑制ELISA中，同一预制备的体系既可以测定抗原，也可以测定抗体。 图5直接竞争抑制ELISA原理     如同间接ELISA一样，直接竞争抑制ELISA也有两步信号放大的过程，因此其灵敏度也比较高，但是预先包被好固相载体并加入酶标抗体后，实验时只需要将待检抗原或抗体稀释后加到体系中进行反应即可，大大简化ELISA的操作过程。用到此系统的试剂盒如德国(LDN) cortisol，DHEA-S,Estradiol等这些指标。     间接竞争抑制ELISA可以看作是用待检抗原或待检抗体干扰一个预先制备的间接ELISA系统。其具体原理是：将抗原包被于固相载体上，依次加入特异性的抗体以及此抗体对应的酶标二抗作为预制备的体系。实验时，加入稀释好的待检抗原（或抗体），待检标本中的抗原（或抗体）就和预制备体系中固相载体上结合的抗原（或抗体）竞争结合特异性的抗体（或固相载体上结合的抗原）。同间接ELISA一样，间接竞争抑制ELISA也有三步信号放大以其灵敏度也比直接竞争抑制ELISA高。试剂盒（PHOENIX）ACTH,CRF指标中会用到此系统。     从上述原理可以看出，竞争抑制ELISA对试剂的要求非常少，不管是单抗还是多抗都可以用于实验，更重要的是不管被检对象是大分子物质还是多肽、小分子药物、小分子激素等只有一个表位的分子不能使用夹心ELISA的都可以使用竞争抑制ELISA检测。另外，像乙肝标志物检测中，e抗原很不稳定，容易降解变为核心抗原，因此在检测e抗体时不能用夹心ELISA检测而只能选用竞争抑制ELISA。     除以上介绍的几种基本的ELISA外，人们还可以根据自己的实际需要灵活设计其它类型的ELISA，例如引入非酶标二抗或者ProteinA、ProteinG等增加固相载体的载量或者增加系统的特异性等。

免疫组化具体操作步骤    免疫组化是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素） 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术（immunohistochemistry）或免疫细胞化学技术（immunocytochemistry）。    一、免疫组化操作    1、石蜡切片脱蜡至水。    2、3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。    3、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 【如需抗原修复，可在此步后进行，    抗原热修复    （1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。    （2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。    （3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR,Bax,Bcl-2,C-fos,X-jun,C-kit,C-myc,E-cadherin,Chromogranin A,Cyclin,ER,Heat shock protein,HPV,Ki-67,MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras,Rb,TopoismeraseⅡ等。    】    4、5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。滴加一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜。    5、PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。    6、滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。    7、PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。    8、滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素（通过化学发光反应发出的光在特定仪器上进行测定）工作液，37℃孵育10-30分钟。    9、PBS 冲洗，5 分钟x3 次。    10、显色剂显色 3-15 分钟（DAB或NBT/BCIP ）    11、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。    二、免疫组化（ LP 法）操作步骤    1. 切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行    2. 缓冲液洗 3min/2 次。    3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。    4. 缓冲液洗 5min/2 次。    5. 滴加 Ultra V Block , 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。    （注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 - 10% 正常羊血清，这一步可以省略。）    6. 缓冲液洗 5min/2 次。    7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 - 2 小时。（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）    8. 缓冲液洗 5min/2 次。    9 . 滴加 Primary Antibody Enhancer（ 增强子 ） , 在室温下孵育 20 分钟。    10 .缓冲液洗 5min/2 次。    11 .滴加 HRP Polymer（ 酶标二抗 ） ,在室温下孵育 30 分钟。    （注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。）    12 .缓冲液洗 5min/2 次。    13 .向 1ml DAB Plus Substrate （ 或 AEC Plus Substrate） 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 - 15 分钟。（具体时间由染色深浅决定。）    14 .自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。