如何建立一个峰形好、分离度大、灵敏度高的分析方法？

了解样品的主要性质，是选择分离模式的关键。针对特定的分析物，选择合适的分离模式，是进行有效色谱分离的首要问题。

色谱柱的选择是建立液相色谱方法时必须考虑的问题，选对色谱柱往往可以实现事半功倍的效果。常用的色谱柱主要有C18、C8、苯基柱、氰基柱、氨基柱、离子交换柱等。

C18柱是方法筛选时最常用的色谱柱，对于疏水性较强（LogD＞0）的待分析物往往有很好的保留。C8和C4柱等是保留能力稍弱于C18的经典反相色谱柱。另外，根据待分析物分子量、流动相中水相比例、pH等的差异，可以选择不同类型的色谱柱。

苯基柱和五氟苯基柱存在中等强度的疏水相互作用和强π-π相互作用，五氟苯基柱还存在强的偶极作用，对于芳香族化合物，特别是苯环上的位置异构体，常规C18无法通过疏水相互作用将其有效分离，苯基柱可以通过它们之间的π-π相互作用差异实现分离。

对于C18上没有保留的化合物，氰基键合相是个很不错的选择。氰基键合相在正相和反相模式中均可以使用。在反相色谱中，氰基的疏水性相对较弱，且由于具有π-电子作用，适用于C18柱保留较弱的样品。在正相色谱中，氰基的极性相对更弱，是保留能力最小的正相吸附剂。

氨基柱可用于正相、反相和弱阴离子交换，在反相条件下特别适合分析糖类物质，在正相条件下可用于分析一些溶于烷烃、烯烃和芳香烃的有机化合物，在低pH缓冲液中能分离带负电荷的分子。

流动相的选择和比例调整是开发方法最重要的环节，很多时候分离度不好、峰形差的问题都可以通过调整流动相来解决。流动相的选一般遵循由强到弱，先粗调再微调的思路。

由强到弱：即首先选择强洗脱条件，以快速得到分离结果，然后再根据出峰情况调整流动相比例。

先粗调再微调：当分离达到一定程度，对流动相的比例、缓冲盐pH等条件的调整就要做的更加精细，以优化得到最佳分离条件。

柱温对保留时间、柱压和峰形都有一定的影响。一般来说，升高柱温，保留时间缩短，柱压降低。但有时也会出现保留时间随柱温升高而延长的情况，特别是用键合极性基团的反相柱分离一些极性化合物的时候。

对于一些拖尾较严重的化合物，适当升高柱温，可以有效改善峰形和柱效。对于大分子的分析，尤其是运行流速较高时，适当升高柱温，可以降低柱压、改善柱效。在手性分离中，一般则是低柱温有利于提高分离度。

柱温对峰面积的影响一般不怎么明显，只有部分离子化合物在不同温度下的电离程度不同，吸收波长和吸收强度会随之发生变化，从而影响峰面积大小。

一般情况下，溶剂对峰形的影响比较小，但是对于一些峰分叉、拖尾等异常色谱行为，也要考虑到溶剂效应的影响。特别是在溶解样品的溶剂强度大于该样品出峰时流动相强度时，容易出现色谱峰的展宽或者分叉（反相色谱中的溶剂强度顺序为水＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜四氢呋喃＜丙醇＜二氯甲烷）。

另外，在进样体积较大或溶剂和流动相兼容性差时，也容易导致峰形问题，甚至是保留时间差异。溶剂和流动相的pH差异有时候会引起化合物电离状态的变化，也会引起峰形和保留时间问题。