HPLC方法开发缓冲盐的选择

水相流动相的使用，是采用反相色谱法进行离子化合物分析检测的关键步骤：包括pH值对分析物保留的影响、缓冲盐的类型与浓度、缓冲盐在有机溶剂中的溶解度及其对检测的影响等。缓冲盐种类、离子强度和pH值等选择不当，会导致对极性化合物和可电离化合物进行反相分离时，存在不良或不可重现的保留和拖尾现象。

分析物部分离子化，分析物与固定相自由硅醇基和其他活性位点之间较强的作用力等问题，可通过选择合适的缓冲范围、正确的缓冲盐种类及其浓度（离子强度）来改善。灵敏的LC-MS分析，更加注重酸、碱、缓冲盐种类和其他添加剂的选择：缓冲液不能抑制分析物的电离。

反相模式中，离子化合物的保留主要由流动相pH值来决定。离子官能团的解离性能同样影响化合物的保留。非离子化合物的保留几乎不受流动相pH值的影响。对于含酸性基团的化合物（羧酸盐居多），pH值低于化合物pKa可增强保留，对于含碱性基团的化合物（胺类居多），pH值高于化合物pKa可增强保留。

在pH值离pka较远的位置，较小的pH值变化对非质子-质子种类的比例影响很小。因此，中等pH值变化不会对保留产生明显影响。pKa附近pH值的微小变化，会对两种物质的比例产生明显的影响。因此，改变接近pKa的pH值，会明显影响化合物的保留。当pH值作为增加化合物保留的手段时，考虑方向应该是尽量降低分析物的离子化。缓冲液是弱酸与其共轭碱，或弱碱与其共轭酸的溶液。

缓冲液降低氢离子、水合氢离子和氢氧根离子的影响，从而较少包括稀释在内的pH值波动。反相模式下，经典的硅胶基质填料的pH值耐受范围是2-8。缓冲液的选择通常由所需的pH值决定。缓冲液的pKa必须接近所需的pH值，因其在pKa处最容易控制pH值。经验法则是选择一个pKa值<2个单位的所需流动相pH的缓冲液。