案例分享 | 带你了解多肽的分离

月旭

2022/09/14 10:06

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01 多肽的性质

多肽由多个氨基酸依次连接而成的化合物，氨基酸是两性化合物，具有两性离子的特性。

02 影响多肽分离的因素

色谱柱填料孔径（120Å、300Å）

添加剂及浓度（甲酸、离子对试剂）

洗脱溶剂（乙腈、甲醇、异丙醇）

梯度

温度

流速

孔径是指硅胶球上小孔的直径。分子进入小孔，在小孔内被键合的烷基吸附，达到分离的效果。孔径小，含孔率高，比表面积大，载碳量高。分子在孔内分离，孔径大小必须和分子大小相匹配，分子必须能进入孔内，一般小分子使用80-120Å，大分子通常使用300Å，为了达到最佳分离，一般要求孔径直径是分子直径的3倍以上。

低pH减少了酸性侧链的解离，离子对试剂（比如三氟乙酸）与肽链碱性侧链作用，中和其电性，电荷的减少使多肽的疏水作用增强，碱性多肽侧链与硅醇基无法产生吸附，但离子对试剂会使得MS的离子化效率降低。Mid-Autumn Festiv

03 项目案例

液相上的分离：

色谱柱：月旭UItimate^® XB-C18（2.1×100mm，5μm 300Å）。

流动相：梯度 A（0.1%三氟乙酸） B（0.1%甲酸乙腈）；

柱温：40℃；

紫外检测器：220nm；

流速：0.3mL/min；

进样量：5μL。

讨论：

多肽化合物分子量大约为2000，选择120Å孔径和300Å孔径均可以达到有效保留，在实验过程中发现120Å的峰形差，分析可能是该物质在这个体系中的分子体积较大，故在300Å的柱子上峰形有了明显的改善。可见分子量可以用于选择填料孔径的参考，但不是绝对的，做多肽时建议常规孔径120Å和大孔径300Å的色谱柱都做一下尝试，选择更合适的孔径；

流动相中使用甲酸为添加剂时没有保留，选择具有离子对作用的三氟乙酸时保留良好，该体系是检测多肽时的常规首选体系，再根据该体系下的结果进行调整。