水相比例在HILIC模式下对分离有何影响？

洗脱原理主要是极性相似相容和亲水分离分配模式，洗脱时极性强的溶剂越多，保留时间越短；出峰顺序是极性弱的先出，极性强的后出，与反相相反，因此适合保留极性强，在反相上无法保留的物质。

CTP、ATP、GTP、UTP的分离：

ATP：三磷酸腺苷

GTP：三磷酸鸟苷

CTP：胞嘧啶核苷三磷酸

UTP：三磷酸尿苷 

分析：各峰分离良好，但出峰均在纯盐相段出峰，保留弱，部分目标峰的峰型不好，方法重现性不好，易与溶剂峰重合。

分析:  四种物质分离完全，保留适中，但有杂质峰干扰风险，峰形有可以优化的空间，减少水相，延长保留。

分析：分离良好，峰形改善，杂质无干扰，各目标峰保留增强很多，一针运行时间较长，流动相中水相比例对保留与分离影响较大，与HILIC的分离原理符合，水相为强洗脱能力项，微小比例的改变对色谱效果影响大，水相比例减小。

分析：与预期相一致，保留时间缩短，与杂质能较好分离，可以尝试梯度，在HILIC模式中水相的微小变化对色谱图影响大，因此两针之间的平衡时间建议在10倍柱体积以上，而且平衡时间一致，也可以让系统达到一个动态平衡，以保证分离效果的重现。

运行HILIC模式时：

1. 考虑样品极性和溶解性：首先目标一般是强极性物质，且最好是在高比例有机相中有一定溶解性，如果样品在有机相中不溶或溶解度很低，或容易产生其他反应的，则不适用；

2. 考虑缓冲盐与有机相的互溶性：调节流动相比例时，如果流动相中含盐，要考虑盐在有机相中的溶解度，避免出现盐析等现象；

3. 关注系统真正的平衡状态：系统平衡不仅仅是关注基线噪音和漂移的问题，是连续进样获得稳定的保留时间和峰面积，测试过程中会碰到系统平衡慢的问题，需要附上解决或改善方法；

4. 关注样品的稳定性：确保所使用的样品溶液是最接近初始状态的，测试过程中需关注溶液稳定状态，必要时临用新制；根据整个方法时样品的主峰情况确定最终的配制方法和保存方法。