蛋白纯化四大层析原理

基本原理：凝胶层析亦称凝胶过滤、排阻色谱或分子筛层析等。其机理是分子筛效应，主要根据蛋白质分子的大小进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质。单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度快；小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。一般来说，凝胶过滤层析柱越细、越长纯化的效果越好。

基本原理：据负载电荷的不同分离蛋白质，分辨率高且对样品的容纳能力强。分离原理是基于带电蛋白质和带相反电荷的色谱介质之间的可逆相互作用。蛋白质结合到柱子上，然后改变条件，使结合物逐步被洗脱。

这种洗脱通常是通过增加盐浓度或pH值的变化来进行，采用逐步调整或连续梯度进行洗脱。最常见的，使用盐（氯化钠）溶液进行梯度洗脱，通过结合过程浓缩靶蛋白，并且以纯化、浓缩的形式收集。

基本原理：根据蛋白质疏水性的差异分离蛋白质。分离的依据是蛋白质与层析介质的疏水表面之间可逆的相互作用。这种作用在高离子强度缓冲液中增强，从而疏水性相互作用层析成为硫酸铵沉淀或离子交换层析过程高盐溶液洗脱后理想的“下一步”。样品在高离子强度溶液（如1.5M硫酸铵）中结合到柱子上。然后改变条件，使结合的物质逐渐洗脱下来。

洗脱通常是通过降低盐浓度。盐浓度要逐步调整或有一个持续减少的梯度。最常见的是通过硫酸铵盐浓度递减的梯度来洗脱样品。在结合过程中靶蛋白被集中，并以纯化和浓缩的形式被收集。其他洗脱程序包括降低洗脱液极性，使用促溶剂（尿素、盐酸胍）或使用去污剂，改变pH值或温度。

基本原理：据特异性生物识别，即一种蛋白（或一组蛋白质）和色谱基质上一种特定的配体间可逆的相互作用。这项技术是捕获或中度纯化步骤理想的选择，只要靶蛋白有合适的配体就可以使用该技术。