凝胶柱的选择
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在选择凝胶柱时,从外观、质地结构和性能来讲,所选柱子要透明光滑,内径一致,耐压防腐,柱子物料须生物兼容,并有良好的物理化学抗性和稳定性。一般的柱材料多为玻璃或有机玻璃,在使用钢柱时,特别要注意防腐蚀。另外,柱子终端要有采集器和过滤网,柱底板要求耐压且不容易堵塞。死体积应小于0.001Vt,如果死体积过大,被分离组分可能会重新混合,导致洗脱峰出现拖尾现象,降低分辨率。底板过滤介质要求新,且带有能与凝胶融合的网孔,避免接触网孔和过滤介质的表面,因为指纹会使样品的分离程度下降。在装柱或重新装柱时,所有部位必须彻底清洗干净。 凝胶柱的长度和内径主要取决于加样体积的多少和对分辨率的要求。凝胶柱的长度对分辨率的影响较大,长柱的分辨率要比短柱的高,但过长会引起柱内不均一、流速过慢,柱长度一般不超过100cm。同时,也要有适当的柱内径,内径过粗会产生蛋白样品较为严重的横向扩散现象,内径过细,靠近柱内壁的流速会大于中心的流速,产生“器壁效应”,影响分离速度和效果。通常使用的凝胶柱长度在25-70cm,内径在4-16mm,H/D(高径比)一般在 (25:1)-(100:1)之间。用于组别分离的凝胶柱,其H/D 可相对低一些;进行分级分离时H/D可在(30:1)-(100:1);而脱盐柱由于对分辨率的要求较低,一般用短柱,H/D大多在(5:1)-(25:1)之间。如果要分离的蛋白质分子量相差较大,可选用H/D=(15:1)-(50:1)的柱子,且柱体积要大于4-15倍的样品体积;如要分离的蛋白质分子量差异较小,则选用H/D=(20:1)-(100:1)的细柱,且柱体积要大于25-100倍的样品体积。在纯化蛋白质时,为了得到较好的分辨率,柱子的H/D 应在(20:1)-(40:1)。 此外,选择柱子时还应考虑凝胶颗粒的大小。如填装小颗粒凝胶,适合使用较大直径的色谱柱;用粗颗粒填装时,则用较小直径的柱子。
凝胶的预处理
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市售凝胶一般呈干粉颗粒状(如 Tandex) 或水悬浮状 (如Tanrose CL)。一些不宜在脱水干燥状态下保存的凝胶 (如琼脂糖凝胶),应存放在含防腐剂的水溶液中,这些凝胶在使用前不需要进行溶胀处理。另外,多孔硅胶和多孔玻璃也不需要溶胀处理。为了尽量减少不同溶剂对柱床体积的影响,获得理想的分离效果,应将干胶缓慢倒入5-10倍干胶体积的洗脱液中充分溶胀。若溶胀不够,则达不到有效的分离,而且在使用过程中会引起凝胶柱破裂。 根据蛋白质样品的分子量和分辨率要求选择好所用凝胶的类型后,再根据柱体积和凝胶的吸水性质估算出干胶的用量。由于凝胶在预处理和实验操作过程中有一定量的损失,所以在实际称取时应高于理论计算值的10%-20%。
不同类型的凝胶所需的溶胀时间不同。一般型号较小、排阻极限较低的凝胶,其吸水量较低,溶胀所需时间较短,在20℃条件下需3-4h即可;型号较大、排阻极限较高的凝胶,其吸水量较大,故所需的溶胀时间也较长,在20℃左右需十几小时到几十小时。
加热溶胀是常用的凝胶预处理方法,即把所称量的凝胶干粉溶在洗脱液中逐渐加热至接近沸腾。这种方法可大大缩短溶胀时间,一般在1-2h内即可完成,而且可起到溶胀、除气和杀菌的三重效果。在凝胶溶胀过程中要不断缓慢搅拌,但不能剧烈搅拌,因为这样容易引起凝胶颗粒的破碎,最终使细小颗粒堵塞凝胶柱而影响到流速和分离效果。此外,还应尽量避免在酸或碱中进行加热溶胀,以防破坏凝胶的网孔结构。
待充分溶胀后,应将凝胶匀浆悬浮,看上清中是否有杂质或不均一的细小颗粒,如有则需反复倾倒去除,直至上清液不再浑浊为止。对溶胀后的凝胶进行除气泡是非常重要的,否则也会影响分离效果,一般可通过真空抽气或加热煮沸的方法排除气泡。由于凝胶价格昂贵,在使用过程中要尽量减少损失和浪费,剩余凝胶要保存好,以备后用。
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