在离子交换过程中保持pH的恒定是十分重要的,正如前面讨论过的,pH的改变会造成蛋白质带电荷数量和分布状况发生变化,从而直接影响到蛋白质是否能结合在交换剂上以及结合力的强弱。因此,在离子交换色谱中流动相必须使用缓冲液。
缓冲液的种类很多,能够起缓冲作用的物质可分为两类:第yi类是由弱酸(或弱碱)及相应的盐构成的系统;第二类是兼性离子化合物。对于第yi类缓冲物质,在进行离子交换时,如果缓冲离子所带的电荷与离子交换剂上的功能基团相反,将参与离子交换过程,并可能对局部pH产生影响,因此应尽可能采用与功能基团带同种电荷的缓冲离子,即:使用阴离子交换剂时选择带正电荷的缓冲离子;使用阳离子交换剂时选择带负电荷的缓冲离子。
当然这也并不是jue对的,比如磷酸盐缓冲液也经常在阴离子交换过程中被采用,但在这种情况下应特别注意在上样前充分平衡,确保色谱系统的pH和离子强度与起始缓冲液一致。第二类缓冲物质在阴、阳离子交换中均能采用。表1和表2分别列出了阳离子交换色谱和阴离子交换色谱时常用的缓冲液。
在离子交换过程中虽然可以除去很多杂蛋白,起到纯化效果,但目的蛋白的洗脱峰中必然含有大量缓冲物质和盐的成分,这些成分的引入对于目的蛋白来说本身也是一种杂质。特别在色谱后需对洗脱峰进行冷冻干燥,以得到纯蛋白样品时,在冻干后的粉末中往往绝大部分是缓冲物质和盐。如果在冻干前进行脱盐或透析操作,虽然可以基本除去这些杂质,但也有可能造成蛋白活性的回收率下降。此时应优先考虑采用挥发性的缓冲物质,这样在冻干阶段可以将这部分杂质除去,常见的挥发性缓冲物质列于表3。
◌ Q /SP/DEAE/CM Tanrose FF
快流速琼脂糖基架离子交换介质
◌ Q/SP Tanrose HP
高分辨率琼脂糖基架离子交换介质
◌ Q/SP Tanrose XL
高载量琼脂糖基架离子交换介质
◌ Q/SP Tanrose BB
大颗粒琼脂糖基架离子交换介质
◌ DEAE/CM Tandex
葡聚糖基架离子交换介质
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