离子交换层析的洗脱

离子交换层析的洗脱会受到线性或分步盐梯度或置换展开的影响。一般zui好先采用线性的盐梯度洗脱，维持梯度约10个柱体积。在zui简单的情况下，梯度操作需两种缓冲液，平衡缓冲液（buffer A）和用于加载相反电荷离子所用缓冲液（buffer B）。大多数情况下，并不需要后半段的梯度，因为多数蛋白质都可以在150-500nmol/L盐浓度下从传统的离子交换剂上洗脱下来。所以，通常zui大梯度到50%足矣。

分步洗脱也可通过buffer A和buffer B实现。也应该意识到也许永远都不会获得一种理想的适用于层析柱的分步洗脱。首先，盐滞留以及HPLC的盲端体积都是决定取样时间的因素；其次，因为缓冲液混合器的特性，仅能获得S形曲线。根据分步洗脱中选择的盐浓度，蛋白质会随着盐峰前端移动或移至盐峰前端的后方。Yamamoto等将其命名为Ⅰ型或Ⅱ型洗脱。当浓缩的洗脱物被冲洗出来之后，所选择的盐浓度必须适于Ⅰ型洗脱。此时的盐浓度可能要比相应采用线性梯度洗脱所达到的zui大盐浓度高一些。Ⅰ型洗脱所需的缓冲液小于1个柱体积。

pH梯度洗脱更难于优化。所以，zui好首先根据蛋白质的pI找到一种条件——此时蛋白质不与离子交换剂结合。若低于pI，宜采用阴离子交换剂；若高于pI，宜采用阳离子交换剂。因此必须降低或提高pH。请记住，离子交换剂本身相当于一种酸或碱，生成pH梯度应遵循 滴定曲线。要获得线性的pH梯度是十分困难的，但是采用含有二元醇的硼酸盐缓冲液可以实现，如甘露醇。第四种洗脱方式是采用手动调节pH梯度进行洗脱。当采用10mmol/L的较低浓度缓冲液洗脱时，使用盐可以导致pH梯度，这种梯度的形成是因为不同种类盐移动情况不同。这种手动调节的pH梯度，可以用于高分辨率，另外也有利于蛋白质峰集中。这种情况下，也需要数个柱体积的缓冲液。

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