液相色谱，你问我答（六)

1、流动相

（1）流动相中有机溶剂的类型和比例，会影响色谱分离的选择性。对于反相色谱模式，常用的有机溶剂有甲醇、乙腈和四氢呋喃。可以通过改变流动相中的有机相种类或调整其比例，来改变选择性和分离度。

（2）流动相的pH值影响分离度。对于中性的化合物，流动相pH值的改变不会对其选择性有太大的影响；对于酸性化合物和碱性化合物(可解离的化合物)，影响较大。

（3）可以通过添加缓冲盐来调整流动相的离子强度，来改善目标化合物与固定相之间的保留。

2、固定相

固定相中键合相的类型，填料的孔径，封端类型以及色谱柱的粒径和尺寸都会影响色谱分离的结果。其中最主要的因素是键合相的选择。当你采用C18固定相无法得到好的分离结果，可以考虑极性较强的C8固定相，或者选择性与其有较大差异的苯基己基柱进行尝试，或者采用封端的色谱柱代替未封端的色谱柱。

3、硬件系统

对硬件系统的一些参数进行调整，也可以在一定程度上改善色谱分离的结果。比如较高的采样速率；采用较小内径的管线和较小的流通池来减小扩散体积和延迟体积减小色谱峰的展宽；或者通过提高色谱柱的柱温来改善分离度。

1、所有组分响应都发生了大致相同程度的改变，可能的原因

（1）进样问题：检查样品瓶和进样针，保证样品浓度和进样体积没有变化。

（2）检测器问题：检查检测器所有参数设置，如果基线噪音很大，通常不是检测器而是系统污染了。

（3）该组分结构是否稳定，进样过程中可能降解。

（4）色谱条件是否发生改变，如流动相比例、pH 值等。

（5）色谱柱改变，选择性改变，效应值也会发生改变。 

2、只有部分组分响应下降了

（1）看一看它们是否相似的挥发性或官能团，针对不同类型的样品，盘查的角度可以有所不同：具有极性官能团（如-OH, -NH, -SH）的样品易被吸附，对污染的系统进行简单的维护。

（2）这些成分性质是否稳定，检测过程中是否发生降解。 

导致这种结果的原因有很多：

如果样品稳定的话，首先排除仪器的故障，有气泡是最主要的一种，气泡的产生会导致进样之间体积的不规律变化。

如果样品之间的浓度相差很大，而进样2-3针后同一个峰的峰面积保持不变，那么可能是样品残留。

峰面积的减少也有可能是温度引起的，但是这个影响很小，小于2%。如果你把样品从冰箱里拿出来放到进样器里，它会慢慢的升温，体积就会变大。这样前后的进样体积就有差别了。

流速的随机变化也会导致峰面积变化。流速改变的另一个潜在原因是系统高压部位漏液了，这个应该很容易发现。

复杂样品中如果有肩峰（与目标峰局部分离），软件就很难判断基线在哪里。这时采用手动积分或者用强制基线自动积分将会改善积分的重现性。样品本身也会造成峰面积变化。在反相色谱中发现有些蛋白质在开始的梯度中不能完全洗脱，残留的会出现在接下来的空白梯度中。这些鬼峰只在特定的蛋白质和洗脱程序中出现。如果是这样，就要在分析样品后添加空白。另外，蛋白质会不可逆的黏附在有些柱子内，随着进样的增加，样品的峰面积会慢慢变大。

压力波动是在日常工作中常常遇到的问题，通常来说，压力波动与色谱柱的关系并不大，主要是仪器系统的问题，下面两点最值得注意：

1、泵内有气泡；

2、单向阀或密封垫渗漏。

解决的途径如下：

1、溶剂过滤后超声脱气；使用在线脱气机；打开purge阀排气泡，或者在溶剂中充氦气；

2、清洗更换单向阀；更换泵密封垫。

1、短期保存色谱柱

反相柱：使用缓冲液或含缓冲盐的流动相，实验完成后应用20-30柱体积的甲醇或乙腈和水的10：90混合物进行冲洗，在用甲醇或乙腈和水的90：10混合物进行冲洗。如需过夜保存，可将流速保持在0.1到0.2mL/min。

正相柱：用流动相洗出样品，再用高比例正己烷：异丙醇冲洗色谱柱，保存。

2、保存色谱柱如色谱柱要长时间保存

必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。特殊类型色谱柱的储存，需参考色谱柱说明书，使用厂商推荐的溶剂。 

1、流速降低

检查并重新设置流速；检查泵是否有气泡；检查泵密封垫是否渗漏，以及单向阀和其它系统渗漏。

2、流动相组成改变

检查系统是否有漏液点；排除系统气泡；补足溶剂瓶；确保梯度系统比例正确；预混合流动相进行等梯度洗脱；流动相组成的问题。在反相色谱中，保留因子k和流动相中有机相的比例是成指数关系的。通常，有机相变化1%，保留时间会变化5%-15%，一般是10%。pH变化0.1会导致保留时间变化10%，所以要准确的测量pH，并且要校正好pH计，在反相色谱中随着pH的增加，酸性化合物保留时间缩短，而碱性化合物延长；离子对试剂的浓度会影响离子型化合物组分的保留时间。带有和离子对试剂相反电荷的分析物的保留时间会缩短，带同样电荷的会延长。正相色谱的保留时间对流动相中的极性成分非常敏感，任何情况下水都是一个麻烦，使用半饱和水的非极性溶剂比如正己烷和二氯甲烷来避免这个问题。

3、键合相流失

对于常用硅胶型色谱柱，要保持流动相pH2~8之间；对于极高pH（>10）或极低pH（<2）的工作，使用高稳定性固定相，聚合物或高稳定性固定相柱。

4、硅胶填料的活化位点

使用流动相改性剂;流动相中加竞争碱;固定相用更高覆盖度的填充料。

5、温度降低

控制柱温。通常温度每变化1℃保留时间变化1%-2%。一般情况下影响没有那么大，显然这种问题用柱温箱就可以避免。

1、色谱柱填料的活性位点

使用流动相改性剂，竞争碱（碱性化合物，如三乙胺）或增加缓冲液强度，使用高覆盖率的柱填料。

2、流动相组成改变

检查系统是否有漏液点；排除系统气泡；补足溶剂瓶；确保梯度系统比例正确；预混合流动相进行等梯度洗脱。

3、样品过载 

减少样品量或使用较大内径或更长的色谱柱。

4、键合相或硅胶基流失 

使用温和pH的流动相；使用耐受高pH或低pH专用硅胶柱，聚合物柱或其它高/低pH柱。

5、 色谱柱老化

使用保护柱，或高稳定性键合相聚合物、混合型或高稳定性柱。

1、液相系统没有平衡好，柱子里的流动相一直在变化，导致基线波动；

2、没有脱气机的仪器，当流动相未脱气或脱气未彻底时，基线会出现尖刺峰；

3、当色谱柱被污染时，也会造成基线波动；

4、检测器的流通池被污染，造成吸收的不恒定，此时需要清洗流通池；

5、检测器灯能量不足时，吸收会变得不稳定，这时基线一般也不稳定，特别是在低波长处尤为明显；

6、当使用低波长检测时，有时流动相会使用两相或以上的等度，这时混合器的很小的混合比例的误差都会被放大，很有可能会使基线发生波动；

7、流动相里的有机相的截止波长zui好要小于检测波长20nm以上；

8、实验室环境不稳定（比如温度忽高忽低，气流不断变化等）；

9、仪器出现问题也会造成基线波动，这种情况下通常也会出现压力不稳。比如流动相过滤头堵塞、入口主动阀滤芯污染、单向阀被污染物堵塞、泵头有气泡、系统流路漏液，比如管路裂开、peek接头没完全连上色谱柱而导致的泄露等。

色谱柱使用寿命大约为1000针，而保护柱的寿命大约为280针。主要受色谱条件及保存条件影响。表现形式：柱压升高、柱效降低、峰形拖尾、峰形变宽、保留时间发生变化、固定相流失等。

1、色谱条件，有两种基本情况：

（1）在相同实验中，以前使用的色谱柱寿命长很多，这种情况，应该检查一下色谱条件是否保持一致。样品的组成，样品中强吸收的污染物会破坏色谱柱的柱效。或者管路的密封圈是否完好？脱落的密封圈会堵塞色谱柱过滤器和填料的顶层，从而影响样品的分布。如果可以确认色谱条件没有变化，那么可以推测是柱床松动的原因。在实验室和运输过程中色谱柱剧烈的震动都会导致柱床松动；

（2）在本实验中用过的所有的色谱柱在使用相同次数后全部损坏，zui大可能是样品中的成分吸附在色谱柱的顶端。可能是在流动相中不溶的沉淀物或者是强吸收的物质；

（3）采用合适的样品准备技术处理样品。用和分析柱相似的固相萃取柱进行固相萃取（SPE）；

（4）使用保护柱。保护柱是作为牺牲柱装在色谱柱前使用的，出现问题的时候就会被替换掉。保护柱的填料和装填技术必须和分析柱一样；

（5）反冲柱子。反现在的装填技术可以使柱子承受反冲，能更好的去除柱头端的污染物。

2、使用方法不对，按照生产商的说明使用柱子的话一般很少发生

（1）流动相pH超出使用范围，导致的柱子键和相水解或基质溶解。样品用强酸或强碱溶解的话也会发生；

（2）高温也会导致色谱柱损坏，如高温会加速键合相溶解；

（3）特殊柱子注意事项，例如氨基柱可以和醛，酮反应。氨基柱在不含缓冲盐的水溶液中会显强碱性，分解部分硅胶；

（4）暴露在错误溶剂中的柱子也会发生坍塌。因为这些柱子是基于非常松散的结构。他们是因颗粒之间的黏着而部分的结合在一起的。如果置于能破化这种黏着的流动相中，柱床很有可能会坍塌。氰基柱在中性溶液，苯基柱在THF中有时就会发生这种问题。这也是不要冲洗柱子的另一个理由。 

1、色谱柱污染

在开始时没问题，在使用一段时间后出现这个问题，可能是由于污染引起的。这时需要对色谱柱加强冲洗，即使用比方法流动相更强的溶剂冲洗色谱柱。

2、保护柱失效

如果样品基质比较脏，使用一段时间之后，发现的峰分叉或拖尾等问题，很有可能是保护柱失效造成的。一般粗略判断标准，塔板数、压力或分离度的改变超过10%，就需要更换保护柱了。保护柱是消耗品，建议直接更换，不需要再生。

3、接头连接不正确

如果色谱柱在使用过程中发现每个峰的峰形都出现问题，先考察是否有连接问题。管线可能太长或太短，这种情况可能导致渗漏或峰分叉/拖尾。如果管线太长，密封圈位置不当，将发生渗漏。如果管线推出的距离不够，将会产生一段死空间，形成混合腔，导致柱外体积，使峰形变坏。

4、溶剂效应

在反相LC中、如使用10O%有机溶剂或10O%强溶剂，大体积进样时，将使色谱峰过早洗脱出色谱柱，导致峰变形。进样溶剂改为用水稀释，与流动相更为兼容，即使进样体积较大也不会出现峰变形。较早流出的峰或靠近溶剂前沿的峰更容易出现拖尾。在液相色谱中用溶于流动相的小体积进样最为理想。

5、样品过载

当进样量超过柱子的容量，样品峰会呈现分叉或拖尾，解决方案就是减少进样量。

6、色谱柱塌陷

由于柱塌陷引起的峰分叉，很难修复。如果流动相pH>7或在色谱柱pH耐受围临界点附近长时间使用，是比较容易造成硅胶填料溶解塌陷。如果出现色谱柱塌陷，您会看到色谱图中的每个峰峰形都会发生变化（峰拖尾、加宽或分叉），短时间内可以反方向运行，建议直接更换色谱柱。日常使用的过程中注意将温度降低到40℃以下，特别是使用高pH流动相时。

7、柱前筛板部分堵塞长期分析脏样品

如果没有保护柱或在线柱前过滤器，颗粒物和强吸附物很可能在柱入口筛板发生堵塞，同时伴随着压力升高，解决办法一般是色谱柱反冲。

8、色谱柱性能下降

使用色谱柱时，会用其分析各种目标物、使用各种流动相并分离不同的样品基质，经过长时间的使用，色谱柱会受到这些物质的影响发生一些微妙的变化，从而引起峰分叉、拖尾或保留时间的改变。