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不同色谱柱和不同批次之间的重现性
问:我要开始开发一个新的HPLC方法。验证之后,该方法将转道QC实验室并将使用许多年。我担心该方法的长期的重复性,特别是柱子的长期重复性。怎样才能确保好的重复性呢?
答:首先,我要表扬你在开始做这个方法的时候就能考虑到这个方面。如果可以预料到该方法将要使用好几年,在选择柱子方面就要做些功课。要想使柱子在该方法的可预见的适用期内使用,就要选择一些大的生产厂家。另外,要选择一种标准的表面化学物质(比如C18或C8)而不是那些新奇的或很少使用的。
下一个标准才是柱子的重复性,如果你或你的同事以前用过一根柱子有很好的重复性,这是一个很好的起点,同时也要考虑生产商提供的信息。近来有的厂家开始印刷他们的说明和不同批次的重复性实验的结果。你可以从厂家得到这些信息然后细心对照。
问:我该从这些信息中寻找什么呢?
答:我们先来解释一下不同柱子和批次之间重复性的不同方面。下面就说一下反相填料,因为他们更加普遍。
如果你用同一批填料的不同柱子,将会得到不同的塔板数(峰宽),不同的柱压,不同的保留时间。保留时间与填料密度和柱体积呈比例改变,而柱体积则取决于柱子的内径。这个改变对你的方法应该是没什么影响的,因为所有峰的保留时间都呈比例的改变,而分离度还是没变。这个原因导致的保留时间变化的RSD通常在3%左右,但是如果生产商对柱子的硬件有很好的控制,RSD也可以低到1%。柱子塔板数的变化会影响方法,特别是做双峰的时候,它们很少能达到基线分离的。尽管2-3%的塔板数的标准偏差已经可以达到,但通常还是在±10%,记住塔板数是个平方数,分离度仅仅取决于塔板数的根。所以塔板数2%的偏差相当于峰宽1%的偏差。你要确认一下柱子的厂家是有塔板数的上下限,还是只有一个下限,上下限都有比较让人满意。
同一装填程序的柱子其柱压的重复性是相当好的,同一批次变化应不超过±5%。
问:那么批次之间的重复性怎么样呢?
答:如果你注意一下批次间的色谱参数,你会发现同参数会不同,更重要的是批次间分离的选择性也会改变。就是说峰的相对保留会改变,比如他们在色谱图中的相对位置,这对你方法的确定性是不利的。
这种改变是你要尽量避免的,所以你要从厂家那里得到一些消息,他们是怎么确保批次之间重复性的,这包括一些物理,化学,色谱方面的测试。在物理测试中,zui重要的一项是装填的表面积,该项参数的变化会直接导致保留时间的变化。所以你要知道厂家认可的批次间表面积改变的幅度是多少。通常情况下幅度是±10%,但是±5%也是可以达到的。化学方面的参数zui重要的是键合相的表面覆盖率。通常用多少μmol/m2 表示。许多厂家并没有直接给出这个参数,而只说明了C的百分含量。我们希望看到的这个代替性的说明以及一个紧凑的幅度,通常是±10%,低于±4%的也可以达到。
zui后你要知道厂家的色谱重复性测试,通常色谱柱会附带一张色谱图,检测的是一些简单的中性化合物的混合物,例如甲苯,萘和蒽等。但是这不是一个好的批次间重复性测试。因为这些中性疏水化合物的相对保留重复性相当好,对装填中表面覆盖率的改变是相当不敏感的。好的批次间重复性测试还应在混合物中添加强碱化合物。在精心设计的测试中,精选的碱性化合物主要与残余硅羟基作用,而中性化合物则主要与键合相作用。只有含有2种化合物的重复性测试才是让人信服的。如果一个厂家是这样测试的并且有好的重复性,那么他的柱子会更加让人放心。
问:我不知道厂家的测试与我的化合物的检测有什么联系,我应该怎样在我的检测中确保一个好的批次间重复性呢?
答:你说的很对,上面的消息只能让你有一个比较大的机会确保重复性。但zui后必须用你自己的检测来做重复性测试。有些厂家提供一整套的设备包括不同装填批次的柱子来做这个测试,另外有的厂家则按要求提供不同批次的柱子,你要了解你所得到的东西。同一装填批次的色谱柱是没有用的,你需要的是用不同键合反应装填的柱子。如果同一批次是不同天内装填,然后色谱柱编号又不同的时候的时候,你zui好询问2次,确保厂家给你的是你要的。
你需要3根不同批次的色谱柱来为你的方法做重复性测试。如果批次间的改变不影响你的检测,那么接下来的时间你的方法应该有一个好的重复性。
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