1 概述
谷胱甘肽-S-转移酶(GST)是生物体内的一类重要的代谢酶,参与外源和内源有毒物质的代谢。GST通过催化还原型的谷胱甘肽(GSH)和有毒物质偶联反应,使有毒化合物的水溶性增加从而更容易排出体外,最终达到解毒的作用。利用这个原理,将GST做成标签表达出融合蛋白,与带谷胱甘肽配基的亲和介质特异性结合,从而纯化出目标蛋白,再用特异性的酶将GST标签切除从而得到天然蛋白。
2 GST标签
GST标签是一种常见的标签,它能够增加外源蛋白的可溶性,很好地保留了蛋白的抗原性和生物活性,可在不同的宿主中表达,适应范围广,能够提高外源蛋白的稳定性,可用不同的蛋白酶去除且具有高特异性,纯化方便、温和。但它也有一定的缺点,比如分子量较大,可能会影响蛋白质的功能和下游实验,因此纯化后需要去除标签,并且如果蛋白不可溶,很难用变性的方法纯化。
3 GST亲和层析
GST亲和层析是利用GST融合蛋白与固定的谷胱甘肽(GSH)通过硫键共价结合,通过GSH交换洗脱的原理来进行纯化。该纯化柱中,凝胶手臂上通过硫键结合一个GSH,然后利用其与GST-tag之间酶和底物的特异性作用力,使得带GST标签的融合蛋白能够与凝胶上的GSH结合,从而将标签蛋白与其他蛋白分离开。
4 月旭GST亲和层析填料
5 GST融合蛋白纯化步骤
1、将GST Tanrose 4FF 装入合适的层析柱,层析用5倍柱体积的结合Buffer进行平衡,使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下,起到保护蛋白的作用。
2、将样品加到平衡好的GST Tanrose 4FF中(保证目的蛋白与GST Tanrose 4FF充分接触,提高目的蛋白的回收率),收集流出液。
3、用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋白,收集洗杂液。
4、使用5-10倍柱体积的洗脱Buffer,收集洗脱液,即目的蛋白组分。
5、依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料,最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡,然后保存在等体积的20%的乙醇中,置于4度保存,防止填料被细菌污染。
6 应用实例
层析柱:PreCot 5ml GST 4FF;
样品:重组表达GST标签蛋白;
结合缓冲液:20mM PB , 150mM NaCl, PH7.4;
洗脱缓冲液:15mM还原型谷胱甘肽, 50mM Tris PH 8.0。
7 常见问题解答
1. GST蛋白结合效率低,该怎么办?
①可能原因:上样流速太快,结合时间太短。
解决方法:降低流速,保证足够的结合时间。
②可能原因:缓冲液不合适,柱子平衡不到位。
解决方法:将缓冲液pH控制在3-12之间,用至少5倍的柱体积平衡柱子。
③可能原因:样品中GST融合蛋白浓度太低。
解决方法:先浓缩样品,再进行纯化。
④可能原因:GST蛋白发生变性或聚集。
解决方法:选择合适的细胞破碎方式;发生聚集时可尝试添加1-10mM的DTT促进蛋白溶解;GST蛋白与核酸结合或蛋白之间结合时可添加适量NaCl(100-300mM)。
2、GST蛋白洗脱困难,该怎么做?
①可能原因:洗脱强度不够。
解决方法:增加洗脱体积数;调整洗脱缓冲液pH(8-9)或离子强度(100-300mM氯化钠)。
②可能原因:非特异性吸附。
解决方法:洗脱缓冲液中加入1%-2% Triton X-100。
③可能原因:洗脱缓冲液中的谷胱甘肽被氧化了。
解决方法:洗脱缓冲液需现配现用,也可尝试加入1-5mM的DTT。
3. GST蛋白纯化后纯度太低,该怎么做?
①可能原因:GST融合蛋白降解。
解决方法:加入蛋白酶抑制剂防止降解。
②可能原因:在宿主细胞内表达过程中GST标签脱落。
解决方法:尝试更换宿主细胞或者优化序列。
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