蜂蜜中寡糖的鉴定 （2020版中国药典一部）

1、适用范围

适用于《2020版中国药典一部》中蜂蜜中寡糖的鉴定。

2、测试原理

试样中的高分子糖，经活性炭-硅藻土柱的富集、浓缩，再用薄层色谱法分离、检测。经过与掺有一定含量的麦芽五糖的纯蜂蜜比较，来判定蜂蜜中寡糖的存在。

3、所需耗材和试剂

标准品： 纯蜂蜜、麦芽五糖

样品：阳性蜂蜜

试剂： 乙醇(分析纯)、正丁醇(分析纯)、乙酸(分析纯)、二苯胺(CAS: 537-67-7)、丙酮(分析纯)、苯胺、磷酸(优级纯)、超纯水。

薄层板：硅胶G板200mm×200mm，膜厚0.25mm。使用前应画板，画板方法为下端留2cm，薄层板的宽度为2.5cm，从下端处向上量3.5cm位置画线，此线为Rf值，从下端2cm处向上量10cm位置画线，此为爬板终点线，爬过此线视为爬板过程结束。画好板后需要在110 ℃恒温干燥箱中活化1h后，置于干燥器中放冷至室温，备用。

固相萃取柱：月旭Welchrom® HON蜂蜜专用柱，规格：500mg/12mL

4、实验步骤

4.1 SPE 前处理步骤

活化：25mL水，过柱流速1滴/秒；

上样：在50mL烧杯中称取2g试样，精确到1mg，溶于10mL水后，缓慢加到月旭Welchrom® HON蜂蜜专用柱上；

淋洗：25mL 7%乙醇水；

洗脱：10mL 50%乙醇水，收集洗脱液；

浓缩及复溶：收集的洗脱液置于65℃水浴中减压浓缩至干，残渣加入30%乙醇1mL使之溶解，作为供试品溶液。(溶解时候要注意确保残渣完全复溶)；

麦芽五糖标准溶液的配置：取麦芽五糖对照品，加30%乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。

注：

1) 整个SPE过小柱的前处理过程都需要用固相萃取真空装置，抽取一定的真空度以确保液体能够滴出小柱；

2) 旋蒸浓缩的时候应使用尽可能小体积的茄形瓶，推荐用25mL规格，以防止复溶的时候因接触面积过大而损失样品；可以少量多次地添加溶剂进行复溶；

3) 用超纯水活化小柱时，注意在液面下降至

小柱填料上端时，即可添加样品溶液上样，切记活化过程中不能将液面抽干，否则会影响小柱对寡糖的保留效果。

4.2  点板条件

TLC板：薄层色谱用硅胶板(涂层厚度0.2-0.25mm)

展开剂：正丙醇:水:三乙胺=60:30:0.7

显色剂：称取1.0g二苯胺盐酸盐置于盛有50.0mL丙酮的烧杯中，再加入1mL苯胺，混合搅拌，同时加入5mL 85%的磷酸，此时会有白色絮状物出现，完全溶解后可以使用，此显色剂要现用现配，各种试剂要按照以上顺序添加。

注：

显色剂的添加顺序一定要按照顺序添加，不可颠倒。

4.3 具体点板过程

用10µL微量注射器在距离薄层板下端2cm的位置，点上3.0µL的样液，同时另取一块薄层板，点上同样量经过同样处理的纯蜂蜜和麦芽五糖标准溶液作为对照。点样时点越小、越集中爬板效果就越好。然后将其放置在展开槽中(在展开剂中进行展开，使用250mL的广口瓶作为展开缸，加入10mL展开剂即可)，待爬板结束后(一次跑板的时间大约需用时2.5h)，用吹风机将薄层板吹干后，均匀喷涂显色剂，再次吹干后，放置到110℃的烘箱中烘烤20-30min（烘烤至显色），观察显色后的TLC板的效果。

5、实验结果与判断标准

从恒温干燥箱中取出薄层板，观察TLC板的显色情况，纯蜂蜜只在Rf值0.35以上的区域有2~3个蓝色中带灰色或咖啡色的斑点，相比较麦芽五糖或混有麦芽五糖的蜂蜜却是从原点开始呈现蓝色带状样的斑点群。