液相色谱，你问我答（一）

#1 相对于气相色谱，液相的优势在哪里？

答：液相和气相相比的优势有很多，主要在于应用范围更广。气相只限于容易气化的低分子量物质的分析测定，对象大部分是基础化工原材料；而任何能溶解于某溶剂的物质都能用液相分析，适用对象是分子量从几十到几万的广大范围。在制药、化工、环保、食品等诸多重要领域，液相都已成为主导的分析工具。也有两者都能应用的交叉情况，但液相的制样更简单。液相色谱的出现克服了气相色谱不能直接用于难挥发、热不稳定及高分子化合物的弱点。

#2 经常有客户疑惑，柱子是否可以反冲？

什么样的柱子可以反冲？什么不可以？

反冲后是正着用，还是反着用？

答：一般的正相反相柱应该都能反冲，只有两端筛板孔径不对称的柱子不能反冲，不过目前这样的柱子已经比较少见了。反冲是为了把柱头的污染物冲洗掉，反冲后还是正着用比较好，以免柱子的两头都被污染。月旭的绝大多数色谱柱都是可以反冲，并且我们一直提倡的是：正向使用，反向冲洗。

#3 有的厂商为避免堵塞，使用了较大孔径（2～5μm）的前筛板，这种情况反冲会将填料冲出。那么，在使用说明书中会说明前后筛板的孔径吗？

答：如果前后筛板孔径不对称，厂商肯定也会在说明书里特别提到的。月旭科技的色谱柱前后筛板孔径都是对称的。

#4 反冲的时候要接检测器吗？

答：反冲就是将柱子反向连到系统中，理论上接不接检测器都可以，不过，若样品的确比较脏，污染物比较多的情况，建议不接检测器，直接出口端放空接废液瓶。因为有污染物冲出来，连检测器容易造成检测器的污染。

#5 用离子交换柱做方法开发的时候，用乙腈和水作为流动相，在调整梯度的时候发现，刚开始用60%乙腈，RT为2.5分钟，调到40%乙腈，RT没有变化，30%也没有变化，一直调到20%的时候，RT突然变到了约13分钟，请问这是什么原因？

答：离子交换柱的保留机理主要是静电相互作用力，影响因素主要有离子强度和pH，此外还有氢键等次级作用力，甚至分子排阻作用也可能存在，因而离子交换色谱中，保留机理并非像反相色谱那样简单，更不是单纯的跟有机相的比例呈正相关，需要考虑是否水相比例增大导致了流动相离子强度的改变，或增大了氢键作用力等。此外，离子交换色谱柱的基质是硅胶还是聚合物也有不同的影响。

#6 对于一根常用的C18柱，拿到一根新柱的时候应该怎样进行活化及维护？为什么要这样做？

答：新柱活化，实际上是一个平衡的过程，色谱柱在运输和储存过程中，有可能出现柱内溶剂挥发的情况，导致填料干掉，键合相得不到充分润湿，因此需要活化。月旭色谱柱按照说明书活化方式活化即可。除了用流动相平衡外，有时候还必须用所测样品对新柱进行平衡，具体平衡方式也很简单，把前面用来平衡的进样样品浓度加大，或者不等洗脱完成，连续进样多针。用待测物对新柱平衡，目的是：将硅胶基质填料表面具有非特异性吸附的位点的吸附能力饱和掉。

#7 C18柱会用甲醇从小流量到大流量慢慢活化，这样做的目的是什么呢？

答：C18柱会用甲醇从小流量到大流量慢慢活化，因为，色谱柱到达用户手中时，时间长短不一，在存储和运输的过程中，可能存储液有些挥发，低流速的甲醇可以很好的浸润固定相，使键合相很好的伸展，用溶剂平衡好系统后，可以采取多次进样或者加大进样量的方式以更快的获得重现的色谱图，这样用样品将色谱柱中的活性位点饱和，就不会出现异常色谱现象的情况。

#8 我前几天刚刚装上一个新的C18柱，在进样之前我用100%的甲醇冲了半个多小时。刚才看到上面写的要活化什么的？不知道我只冲洗半小时就开始用对柱子有没有影响？对出峰什么的有没有影响呢？

答：首先，若仅仅是新柱活化，建议严格按照厂家色谱柱说明书的操作进行；其次，样品老化，不是所有的测定，都需要对新柱子用所测样品老化。但先按方法程序进样几针，观察到峰面积保留时间不再有明显变化，再开始正式测定，这是一个好习惯。

#9 测定多肽，一般采用什么柱子？流动相是乙腈和水，还有微量的TFA。特别是像类似三肽的短肽，应该怎么选择柱子？

答：分子量不高的多肽一般选用常规C18或C8柱就能测定，也有用离子交换柱、水性柱和HILIC亲水作用柱的。若流动相中含有三lv乙酸这类酸性添加剂，建议还是使用耐受低pH的色谱柱，如月旭科技Ultimate® LP系列。

#10 氨基柱在进酸性样品时，很伤柱子，如使用一段时间后，柱效降低，峰形改变，如何恢复？

答：氨基柱测酸性样品，应该是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能会使略带负电荷的氨基官能团质子化，导致使用一段时间后对于某些类的分析物保留性质有所改变或表现在柱效下降。建议：用5～10倍的柱体积的含0.5～1.0％NH3的乙腈/水(50/50)溶液冲洗该柱（冲洗后当然要再用不含碱的流动相洗去多余氨），之后，再进行分析这类酸性分析物时建议在流动相中略微添加少许氨，如0.05％。