分子排阻色谱,有时又叫“尺寸排阻色谱”或“体积排阻色谱”,是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。
分子排阻色谱法的分离原理为分子筛机制,色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经过修饰的凝胶,如葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶等为填充剂,这些填充剂表面分布着不同孔径尺寸的孔。分子进入色谱柱后,它们中的不同组分按其分子大小进入相应的孔内,大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部,在色谱过程中不被保留,最早被流动相洗脱至柱外,表现为保留时间较短;小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径,在色谱柱中滞留时间较长,表现为保留时间较长;其余分子则按分子大小依次被洗脱,如下图。
不同分子的物质的分子排阻洗脱示意图
虽说分子排阻色谱的流动相和反相色谱的流动相很相似,但其分离机理却是相差甚远。下表为大家列出了两种分离模式的异同:
那么分子排阻色谱在使用过程中究竟有哪些特别之处,今天就来一探究竟吧。
01 固定相
葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶聚合物基质的填充剂做固定相时,要千万注意流动相和样品中不可以出现任何有机溶剂,否则极易导致基质破碎。如《中国药典》中规定的头孢类聚合物的检测方法:
《中国药典》2020版头孢类化合物聚合物测定
亲水硅胶多为表面键合亲水薄膜的高纯硅胶,具有良好稳定性和批次重现性。如月旭科技Xtimate® SEC填充剂采用独特的化学键合技术,在硅胶表面键合亲水性聚合物以及亲水性二醇基团(如下图):
双重键合机制使水溶性高分子聚合物蛋白、生物酶、多肽等生物样品的非特异性吸附极小,因而可广泛应用于水溶性聚合物及生物大分子的分离和测定。
亲水硅胶填料还有一个显著特点,就是会有众多孔径选择,以适合不同分子量大小的高分子化合物的分离。通常情况下,120?、200?和300?的孔径可适合大多数多肽、蛋白等高聚物的分子量分离,更大分子量的高聚物则要选择更大孔径的填料。
双重键合机制使水溶性高分子聚合物蛋白、生物酶、多肽等生物样品的非特异性吸附极小,因而可广泛应用于水溶性聚合物及生物大分子的分离和测定。
亲水硅胶填料还有一个显著特点,就是会有众多孔径选择,以适合不同分子量大小的高分子化合物的分离。通常情况下,120?、200?和300?的孔径可适合大多数多肽、蛋白等高聚物的分子量分离,更大分子量的高聚物则要选择更大孔径的填料。
《中国药典》2020版通则2341d一法22种有机氯类农药残留量测定法
03 方法开发
在使用月旭科技Xtimate SEC色谱柱进行分子量分布的方法开发中,有以下因素可能影响分离效果:
分子量
可根据目标物的分子量,来选择合适孔径的色谱柱。
样品与流动相
为避免色谱柱堵塞,所有样品和溶剂,包括缓冲盐,都必须在使用前用0.45μm或0.22μm滤膜过滤。Xtimate SEC可以使用水或有机溶剂与水的混合物,与大多数缓冲盐溶液也兼容。流动相使用前需脱气,否则可能出现柱压和基线波动较大。这时可用较大流速冲洗色谱柱2-5min,如对于7.8*300mm的色谱柱,可用1.25 mL/min的流速。
离子强度
色谱柱中不可避免会存在其他次级作用力,为了最大限度降低填料与被测物的次级作用力,必须调整流动相的离子强度。NaCl是SEC分离中比较常用的盐,可通过调整离子强度,减少次级作用力,进而改善峰形和分离效果。
pH
流动相的pH调整,更多也是为了减少色谱柱中的次级作用对被测物的影响,所以测定过程中需选择合适的pH。为获得z佳分离效果和延长使用寿命,建议使用pH在 2-7.5 范围内的流动相。
流速
尽量采用低流速测试,可以提高分离度,进而获得更好的测试效果。内径为 4.6mm 和 7.8mm 的色谱柱,一般建议其正常操作流速分别为 0.1-0.4 和 0.1-1.25 mL/min。
柱长
通过增加色谱柱的长度可以改善SEC分离度,所以在分离过程中,在一根色谱柱达不到分离效果时,可以考虑两根色谱柱串联,甚至不同孔径的色谱柱串联(注:一般大孔径的在前,小孔径的在后)。这种条件下通常也会造成出峰时间延后,及系统压力增加。
柱温
z高操作温度为 80℃。为了获得最长的使用时间,z佳操作温度为 10-30℃。长时间在高温(>80℃)下操作也会损坏色谱柱,这种情形在高的 pH(>7.5)条件下尤其突出。
最后,在使用月旭科技Xtimate SEC色谱柱过程中,注意尽管Xtimate SEC可在高至2000psi 的压力下使用,但正常的操作压力应当低于1500 psi。长时间在高压下运行会损坏色谱柱和输液泵。由于压力来源于流速,因此最大流速将受制于系统所能承受的压力。一般而言,柱压会随着色谱柱使用时间的增加而逐渐增加。Xtimate SEC色谱柱日常使用完后冲洗,建议保存在高比例的水-有机溶剂中。
月旭科技多年专注于色谱柱的研发和生产,推出的色谱柱具有种类齐全、普适性强、峰形优异、超高柱效、批次稳定等特点。欲了解更多内容,欢迎联系月旭科技当地销售同事,我们将竭诚为您服务!
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