分子排阻色谱探究竟

月旭

2020/12/22 16:34

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分子排阻色谱，有时又叫“尺寸排阻色谱”或“体积排阻色谱”，是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。

分子排阻色谱法的分离原理为分子筛机制，色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经过修饰的凝胶，如葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶等为填充剂，这些填充剂表面分布着不同孔径尺寸的孔。分子进入色谱柱后，它们中的不同组分按其分子大小进入相应的孔内，大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现为保留时间较短；小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在色谱柱中滞留时间较长，表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小依次被洗脱，如下图。

不同分子的物质的分子排阻洗脱示意图

虽说分子排阻色谱的流动相和反相色谱的流动相很相似，但其分离机理却是相差甚远。下表为大家列出了两种分离模式的异同：

那么分子排阻色谱在使用过程中究竟有哪些特别之处，今天就来一探究竟吧。

01 固定相

葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶聚合物基质的填充剂做固定相时，要千万注意流动相和样品中不可以出现任何有机溶剂，否则极易导致基质破碎。如《中国药典》中规定的头孢类聚合物的检测方法：

《中国药典》2020版头孢类化合物聚合物测定

亲水硅胶多为表面键合亲水薄膜的高纯硅胶，具有良好稳定性和批次重现性。如月旭科技Xtimate® SEC填充剂采用独特的化学键合技术，在硅胶表面键合亲水性聚合物以及亲水性二醇基团（如下图）：

双重键合机制使水溶性高分子聚合物蛋白、生物酶、多肽等生物样品的非特异性吸附极小，因而可广泛应用于水溶性聚合物及生物大分子的分离和测定。

亲水硅胶填料还有一个显著特点，就是会有众多孔径选择，以适合不同分子量大小的高分子化合物的分离。通常情况下，120?、200?和300?的孔径可适合大多数多肽、蛋白等高聚物的分子量分离，更大分子量的高聚物则要选择更大孔径的填料。

《中国药典》2020版通则2341d一法22种有机氯类农药残留量测定法

03 方法开发

在使用月旭科技Xtimate SEC色谱柱进行分子量分布的方法开发中，有以下因素可能影响分离效果：

分子量

可根据目标物的分子量，来选择合适孔径的色谱柱。

样品与流动相

为避免色谱柱堵塞，所有样品和溶剂，包括缓冲盐，都必须在使用前用0.45μm或0.22μm滤膜过滤。Xtimate SEC可以使用水或有机溶剂与水的混合物，与大多数缓冲盐溶液也兼容。流动相使用前需脱气，否则可能出现柱压和基线波动较大。这时可用较大流速冲洗色谱柱2-5min，如对于7.8*300mm的色谱柱，可用1.25 mL/min的流速。

离子强度

色谱柱中不可避免会存在其他次级作用力，为了最大限度降低填料与被测物的次级作用力，必须调整流动相的离子强度。NaCl是SEC分离中比较常用的盐，可通过调整离子强度，减少次级作用力，进而改善峰形和分离效果。

流动相的pH调整，更多也是为了减少色谱柱中的次级作用对被测物的影响，所以测定过程中需选择合适的pH。为获得z佳分离效果和延长使用寿命，建议使用pH在 2-7.5 范围内的流动相。

流速

尽量采用低流速测试，可以提高分离度，进而获得更好的测试效果。内径为 4.6mm 和 7.8mm 的色谱柱，一般建议其正常操作流速分别为 0.1-0.4 和 0.1-1.25 mL/min。

柱长

通过增加色谱柱的长度可以改善SEC分离度，所以在分离过程中，在一根色谱柱达不到分离效果时，可以考虑两根色谱柱串联，甚至不同孔径的色谱柱串联（注：一般大孔径的在前，小孔径的在后）。这种条件下通常也会造成出峰时间延后，及系统压力增加。

柱温

z高操作温度为 80℃。为了获得最长的使用时间，z佳操作温度为 10-30℃。长时间在高温（>80℃）下操作也会损坏色谱柱，这种情形在高的 pH（>7.5）条件下尤其突出。

最后，在使用月旭科技Xtimate SEC色谱柱过程中，注意尽管Xtimate SEC可在高至2000psi 的压力下使用，但正常的操作压力应当低于1500 psi。长时间在高压下运行会损坏色谱柱和输液泵。由于压力来源于流速，因此最大流速将受制于系统所能承受的压力。一般而言，柱压会随着色谱柱使用时间的增加而逐渐增加。Xtimate SEC色谱柱日常使用完后冲洗，建议保存在高比例的水-有机溶剂中。

月旭科技多年专注于色谱柱的研发和生产，推出的色谱柱具有种类齐全、普适性强、峰形优异、超高柱效、批次稳定等特点。欲了解更多内容，欢迎联系月旭科技当地销售同事，我们将竭诚为您服务！