梯度优化在液相色谱方法开发中是非常重要的一个环节。有时,一个合适的梯度洗脱程序对液相色谱分析分离可起到“四两拨千斤”的作用。然而,许多小伙伴由于梯度优化实验做得相对较少,因此误认为梯度优化非常复杂。今天小编就带大家来揭开反相液相色谱梯度程序的神秘面纱,一探梯度优化的究竟。
一、建立梯度方法的原因
Q 为什么要用梯度的方式来洗脱呢?
当然,作为分析工作者,如果能以一个等度的条件完成我们的分离目的,那便是是皆大欢喜的,但实际情况常常不能如我们所愿。混合样品组分中,必定存在容易分离和不易分离的组分,保留较弱和保留较强的组分。
我们建立梯度洗脱程序的目的就在于,将容易分离的组分在洗脱能力较弱的流动相中实现尽快分离,而保留较强的组分在色谱柱内停留较长时间,与键合相表面发生充分的相互作用,尽可能地彼此拉开,最后用强洗脱能力的流动相洗脱出来,避免洗脱时间过长。
二、反相液相色谱体系流动相的洗脱能力
Q 前文既然讲到了流动相的洗脱能力,那么,反相色谱中,如何来判断流动相的洗脱能力呢?
我们可以来看一下下面这张图:
上图各位小伙伴应该都不陌生,所述的原理即是,在反相体系中,随着流动相的极性不断增加(水相的比例在不断增加),流动相整体的洗脱能力逐渐减弱,而保留时间则在逐渐延长。因此,前文中对于容易分离的组分,可尝试在流动相极性较大的环境下将其实现分离。
同时,为了提高整个样品混合组分的分离度,在整个梯度程序内,也尽可能使用高比例的水相作为梯度洗脱的起始条件。因此,对于很多小伙伴,在进行一个全新的项目的反相条件方法开发的时候,最chang用的初始梯度模式便是在0~40min内,进行一个95%水相%有机相的线性洗脱。
三、反相液相色谱梯度优化中心思路
反相色谱梯度优化的中心思路,其实就是尽可能减弱流动相的洗脱能力,从而减少共洗脱的情况。减弱流动相洗脱能力最y效的方式是更换洗脱强度弱一些的溶剂,或者增减流动相中的添加剂。
然而,很多情况下,小伙伴参照既定标准进行实验,溶剂种类和添加剂的量不便进行过多的调整,这样的情况下,还有一个方法可以调节流动相的洗脱强度,那就是减缓流动相的变化斜率。我们通过下面这个案例给大家说明:
通过上图我们可以看到,在梯度(一)条件下,多潘立酮和杂质D出现共洗脱,峰重叠。于是我们进行梯度程序的调节:
在梯度(二)中,10min时乙腈的比例为45%,而梯度(一)下10min时乙腈的比例为60%,并且梯度(二)中的后7min,乙腈的比例也并未继续升高至100%,这就使得梯度(二)条件中,每时每刻乙腈的比例都低于梯度(一),暨每时每刻流动相的洗脱强度都弱于梯度(一),如下图。如此一来,各杂质共洗脱的情况得到改善,结果就是如图3所示,8个物质都得到了分离。
四、注意事项
在进行方法开发梯度优化的时候,一定要注意兼容性的问题,包括流动相溶剂彼此之间的兼容性,以及流动相和样品的兼容性。
流动相溶剂选择上,最h是选择能够任意比例互溶的溶剂。若是流动相溶剂不方便更换,则需尽量减缓流动相的变化速率,给有机相和水相(盐相)更多的时间来互溶。
对于样品来说,流动相的性质一定要注意与样品溶剂能够兼容,避免出现在进样后的任意时刻样品不溶解、析出的情况。
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