在整个质量标准的各项检查中,有关物质项绝对占据了大半“江山”,同时,在整个质量研究的分析方法研究过程当中,有关物质项也占据了很大的一部分精力。在最快的时间内设计或者选择一个“稳健”的有关物质方法,成为项目完成高效与否的关键。
对于暂未有药典收载的药物,通常会从整个杂质谱的结构分析开始。对于结构的分析,又要往前翻到本系列的第一篇简略质量研究案例(一)点击蓝字回看,根据文中所述,去各网站或者数据库中查询并归纳各个杂质的性质,根据性质来选择波长、色谱柱、流动相等。对于波长的选择,在有关物质方法的检查中,与含量中波长的选择依据有差异。对于含量分析方法来说,更关心的是主成分的吸收,而对于有关物质分析来说,更关心的是各个杂质的稳定检出。杂质限度较低,波长选择的差异容易影响到各个杂质的限度。而流动相和固定相(色谱柱)等色谱条件的选择,则会影响到方法的稳健性。一个稳健的分析方法,会让我们的分析方法验证、分析方法转移等工作更加顺畅。一个耐用性较差的方法,不止会在整个研究过程当中虐得我们si去活来,还会影响研究数据的准确性。
当然,对于我们今天所需要讨论的氟哌啶醇有关物质检查项来说,因为已有各国药典收载,故一般还是从药典方法开始进行筛选。
目前,中国药典、美国药典、欧洲药典、英国药典及日本药典均收载了其有关物质检查分析方法,各药典对比如下:
对比四国药典,均采用C18的色谱柱,EP还特别标注了碱去活封尾色谱柱。从本系列的第一节开始,我们就知道,氟哌啶醇是一个弱碱。在我们接触液相色谱开始,相信绝大多数人都知道,硅胶基质的色谱柱,容易封尾不完全而存在一些弱酸性的硅羟基活性位点(Si-OH),这些活性位点会增强对离子化后的碱性化合物的保留而造成拖尾。当然,碱性化合物的拖尾不止这一点,还包括过载引起的拖尾。对于液相色谱拖尾问题,小编在本公众号之前的一个系列中有详细阐述。(奉送直达车:峰型那些事(一))。除中国药典未标注色谱柱规格外,其他三国药典所用的色谱柱从规格上看,柱效基本一致。流动相体系的选择,则是分离策略的选择。
ChP2015所用的磷酸盐缓冲体系,pH刚好在其缓冲范围外,但是,其磷酸盐浓度较常规使用的高(50mmol/L),应该能弥补这一点,另外,ChP2015的供试品浓度并不高(1mg/ml),也弥补了流动相缓冲能力不够的缺点。但从主成分氟哌啶醇来说,再降低一些流动相pH,比如用pH=3.0,可能更加合适。当然,我们一直所说的,单一个组分无所谓方法,对于有关物质来说,更多的考虑是其他组分,而不单单是主成分。对于氟哌啶醇这个项目,小编纯属纸上谈兵,并未深入,而实际当中具体的选择,还是根据具体的工艺来实现。
对于JP17,其选择的缓冲盐体系刚好在柠檬酸盐的缓冲范围内(pKa1=2.1~4.1),但是,其选择的波长(220nm)又超出了柠檬酸盐的截止波长(230nm),超出了截止波长就意味着本底有吸收,可能会影响定量限的浓度水平。另外,JP17还加入了一个小编很不喜欢的离子对-十二烷基硫酸钠(SDS)。SDS作为阳离子对试剂,一方面可以增加氟哌啶醇的保留,另一方面,则可以改善峰型。但是SDS的使用存在一些缺陷,市售的SDS质量差异非常大,换个品牌或者换个批次,会发生无法重现方法的问题。这是因为市售SDS纯度差异较大的以及组成差异的关系。以SDS为离子对试剂带来的另一方面的困扰是方法耐用性较差,使用的过程当中,必须精确量取流动相的各组分,确保每次配制的流动相比例一致。否则,微小的缓冲盐-有机相比例差异可能会造成较大的保留时间差异。
USP40\EP9.0\BP2019方法一致,均为缓冲液-乙腈体系。在常规的使用中,四丁基硫酸氢铵在大多数场合均作为离子对试剂出现。但在USP40\EP9.0\BP2019方法中,其并不是作为离子对存在。折算下浓度,其在流动相中的浓度也不低(50mmol/L),一方面,作为增加离子强度的缓冲盐,该浓度下溶液的pH应为2~3。另一方面,更重要的,是作为与待测组分相同的离子组分存在于流动相中,形成离子氛,减少氟哌啶醇与固定相间的相互作用,减少拖尾。四丁基硫酸氢铵作为一个阳离子,也能与固定相中的活性硅羟基作用,同样能从另一方面减少拖尾。由此可见USP40\EP9.0\BP2019在多方面改善了有关物质的峰形问题,过载问题(峰形问题),当然,过载后的峰形较差,峰宽较宽,会影响主峰附近的杂质峰分离,进而影响各杂质的定量限浓度。由于有了上述的一些措施,USP40\EP9.0\BP2019的供试品浓度能使用较高的浓度(10mg/ml),较高的供试品浓度意味着更低的检出限。
稀释剂的选择,氟哌啶醇在分子状态其疏水性并不低,故USP40\EP9.0\BP2019选择了纯甲醇来作为稀释剂。而ChP2015和JP17的流动相均为酸性缓冲液和高比例的有机相,且其供试品浓度较低,用流动相作为稀释剂既方便又可以满足稀释的能力。
相较于ChP2015和JP17的等度,USP40\EP9.0\BP2019的梯度方法现阶段更易被接受。一般认为梯度方法能有更高的区分力和区分范围,较等度方法更科学合理。
至于波长及流速的选择,不同的流动相体系也会影响UV曲线的表现以及组分的保留情况,至于如何选择,跟所需分离的有关物质有关。综合考虑,选择最you的组合。
至于供试品浓度及进样量,前述段落中已有所表述。
至于计算方式是选择外标法还是主成分自身对照法,亦或是主成分外标法,还是主成分外标/自身稀释对照外标加校正因子法,取决于产品的特性,从成本角度,方便角度,科学合理角度综合考虑,选择即合理又方便的方式。
限度的考察,第一条即来自于ICH的限度要求。根据每日最大剂量,推算产品的单杂限度。对于药典中已列明的已知杂质,可参照药典标准进行修订。最终定入质量标准的杂质并不是越多越好。越多的杂质表明后续测试愈加繁琐,而我们的目标,是在尽量少的操作中,控制风险,使得产品更加安全可靠。
有没有小伙伴要问小编:难道USP40\EP9.0\BP2019就没有缺点了吗?USP40\EP9.0\BP2019所使用的四丁基硫酸氢铵会吸附在色谱柱上,可能会使该色谱柱改性而不便于其他产品的使用。另外,四丁基硫酸氢铵的使用,可能会减少色谱柱的寿命。对的,成本的增加也是方法的缺陷哦!~我记得在前述的某篇文章中曾提到,没有完美的方法,只有最适合的方法。
ChP2015及JP17,在限度以及各方面均能满足的情况下,也算一个合适的方法。至于如何挑选,一定是综合各方面的情况后综合选择的。至于方法是否在各方面均能满足,需要通过分析方法学验证来确证。分析方法学验证如何做,且听下回分解!~
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