Till 碟片式共聚焦显微镜的原理及相关技术介绍

　　一、激光共聚焦显微镜的原理 　　传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。 　　二、转盘式碟片共聚焦显微镜的原理 　　普通显微镜，指宽场成像显微镜，所谓宽场成像就是“面成像”，所谓面成像就是一个时间点获得一整个二维图像，这是与明显区别于扫描成像显微镜的，如共聚焦显微镜。共聚焦显微镜是“点成像”，即每个时间点只能获得一个空间信息，通过不断花费时间去扫描最终获得整个二维或三维图像，因此扫描成像每个像点不是一个时间点，不管扫描速度有多快。目前市场的碟片共聚焦，属于二者综合性，因为使用多孔碟片，在一个时间点就可以多获得几个空间点信息，但是整个图像也不是一个时间点得到，部分空间信息是一个时间点得到。 　　转盘式碟片共聚焦是多点同步扫描，以Andromeda的转盘扫描头为例，转盘上分布有20000个螺旋排列的针孔，而激光光源覆盖约2000个针孔的范围（即扫描区域），借助转盘的转动（针孔位置随之改变），实现对样品的完整扫描，激发扫描区域内样品，发射光通过碟片上的针孔与激发光照射点共轭，滤除非焦面杂散光。相当于2000个激光点同步照射样品，同步激发，CCD上同步采集，所以扫描速度非常的快，可以实现每秒可以获得成百上千幅共聚焦图像的可能。碟片式共聚焦的最大优势是在图像质量能够接近甚至达到传统共聚焦分辨率的同时，获得活细胞快速变化的图像。 　　三、Andromeda的颠覆性光学设计 　　Andromeda 是转盘式共聚焦的突破性改进，由Till独家开发的Spining disk 转盘，该设计不同以往的双转盘碟片式共聚焦，而只用一个带针孔和聚光镜的转盘同时实现聚焦和扫描的工作。为持续高动态进程的三维成像，如细胞分裂、蛋白转运或相互作用、包囊运动等，提供了完美的多点式碟片共聚焦的解决方案。