利用密度梯度方法进行核糖体分离

核糖体是细胞内蛋白质合成的场所，也是细胞中含量最多的RNA-蛋白质复合体，在真核生物中数目庞大。核糖体除参与蛋白质合成外，还与细胞的生长、分化、细胞寿命、胚胎发育以及癌症的发生有关，在快速生长的酵母细胞中，细胞花费了大部分的能量用于产生、组装成熟核糖体的相关成分，与核糖体生物发生相关基因的转录占到整个细胞转录体系的60%以上。

除此之外，还可通过对核糖体的研究间接了解到某些基因的表达活性或在不同的胁迫条件下，特定基因在细胞内表达量的变化。通过结合于核糖体亚基和多聚核糖体上的RNA，利用qRT-PCR技术，可以直接了解到基因的表达活性。如何实现核糖体的分离，获得相关信息成为了核糖体研究的关键。以下为利用密度梯度方法进行核糖体分离的相关流程及方法，可供核糖体研究的相关人员参考。

在密度梯度液的制备过程中，由于层铺法产生的是点梯度，分离效果差，故采用Biocomp公司生产的全自动密度梯度制备仪进行完全线性密度梯度溶液的制备。在SW41离心管中先加入1/2体积10%蔗糖溶液，再由针头插入底部加入1/2体积45%蔗糖梯度液(每个梯度液加入量以Biocomp提供的标尺为准)，放置于Biocomp梯度制备仪中，选择相应的内置程序(转子为SW41，梯度介质为蔗糖，梯度范围为10-45%)运行，便可直接获得10-45%完全线性蔗糖梯度溶液。

关于细胞样品的处理，以培养的Hela细胞为例，先用PBS(pH 7.4)洗两次，然后加入细胞裂解缓冲液，缓冲液包含50mM Tris-HCL，100mM KCL(或NaCl)，5mM MgCl2，1mM DTT，100ug/ml cycloheximide(环己酰亚胺)，40U/ml RNasin，以及1% NP-40和1% sodium deoxycholate(脱氧胆酸钠)。

裂解后的细胞，首先对细胞裂解液进行预离心，4℃，10000-13000rpm离心10min，然后取上清液上样于10-45%蔗糖密度梯度溶液中，梯度液包含20mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM MgCl2, 100mM NaCl以及50ug/ml cycloheximide。对于核糖体的分离多依据各组分的沉降系数的不同，因此采用速度区带离心方法。放置离心管于Beckman超速离心机中，转速36000-40000rpm，4℃离心2-3h，使得核糖体亚基及多聚核糖体在梯度溶液中得到分离。

核糖体分离后的收集及绘图，手动方法收集易产生分层的扰动，且无法绘制吸收峰图。故采用Biocomp全自动密度梯度分离系统进行收集，结合紫外检测器，检测样品在260nm处的吸收，实时绘制吸收峰图。利用馏分收集器进行分管收集样品，通过吸收峰图对应的离心管号，便可以直接获得各核糖体亚基或多聚核糖体上的RNA，结合qRT-PCR等技术可进行进一步相关研究。

参考文献：

1. Adam Amsterdam, Kirsten C. Sadler and Kevin Lai et al.2004 Many Ribosomal Protein Genes Are Cancer Genes in Zebrafish. PLoS Biology 2(5): e139. doi:10.1371/journal.pbio.0020139

2. Emiliano P. Ricci, Fabrice Mure and Henri Gruffat et al. 2009. Translation of intronless RNAs is strongly stimulated by the Epstein-Barr virus mRNA export factor EB2. Nucleic Acids Research, 37(15):4932-4943

3. Lakshmi Reddy Palam, Thomas D. Baird and Ronald C. Wek. 2011. Phosphorylation of elF2 Facilitates Ribosomal Bypass of an Inhibitory Upstream ORF to Enhance CHOP Translation. The Journal of Biological Chemistry, 286(13):10939-10949

4. Marie-Cecile Didiot, Murugan Subramanian and Eric Flatter et al. 2009. Cells Lacking the Fragile X Mental Retardation Protein(FMRP) have Normal RISC Activity but Exhibit Altered Stress Granule Assembly. Molecular Biology of the Cell, 19,428-437

5. Ruiqing Yang, Sergei A. Gaidamakov and Jingwei Xie et al. 2011. La-Related Protein 4 Binds Poly(A), Interacts with the Poly(A)-Binding Protein MLLE Domain via a Variant PAM2w Motif, and Can Promote mRNA Stability. Molecular and Cellular Biology, 31, 542-556

6. Takao Mori, Chiharu Ogasawara and Toshifumi Inada et al. 2010. Dual Functions of Yeast tRNA Ligase in the Unfolded Protein Response: Unconventional Cytoplasmic Splicing of HAC1 Pre-mRNA Is Not Sufficient to Release Translational Attenuation. Molecular Biology of the Cell, 21,3722-3734