法国VILBER Fusion系列光学活体成像的应用

五洲东方

2012/08/10 16:36

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目前，进行动植物活体成像的主要方法手段包括结构成像及功能成像。结构成像主要采用超声、计算机断层摄影（CT）、核磁共振等方法，而功能成像则主要采用光学成像的方法。光学成像主要采用生物发光（Bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术在活体动植物内进行生物标记，通过成像系统来检测被标记动植物体内分子及细胞等的发展进程，可进行癌症及药物研究、病毒学及基因治疗、细胞凋亡、蛋白质相互作用及转基因动物模型等。

    在光学活体成像过程中，还面临着一些挑战。首先，受探针或染料所处动物体内的位置的影响，位置越深，使得信号越难以穿透动物皮肤而难以被检测到；其次，选择的激发光源波长及染料的发射波长较短，同样无法很好的穿透皮肤；最后，由于探针或染料通常通过尾部静脉注射，探针会被动物的血液和组织所稀释，在活体内的信号就比较弱，因此，选择的探针或包被染料的纳米材料等最好有靶向性。
    针对以上问题，法国VILBER研发生产的Fusion FX7多功能成像系统，采用了四级半导体制冷CCD，相对于室温可低至-67℃，暗电流仅有0.0002e/p/s，极大地降低了背景噪点；1.2inch大面积CCD感应器配以f0.84大光圈定焦镜头，最大程度减少光信号的损失，提高检测灵敏度，即使动植物体内发出很少的光子也能够检测到信号。由于在活体成像过程中，激发光源的波长及频率对于染料的激发有很大的影响，波长越长，频率越高，越能穿透动物皮肤组织，提高激发光的射入。VILBER Fusion FX7独有的Pulsed light技术，提高了光源的发射频率，从而提高了单位时间内的入射光量，另外，Fusion FX7 IR Spectra具有640nm红光及740nm远红光激发光源，可以有效穿透动物皮肤组织，激发染料后获取更多的发射光信号。

    在活体成像实验过程中，还需要注意以下几点：首先，尽量选择激发波长和发射波长较长的荧光染料，如CY5、CY5.5、Qdot 705或Alex Fluor 700等，如果利用荧光探针，则尽量确定探针体外表现稳定可靠，并确定发射波长或强度，也可用血液等生物体液溶解探针观察其变化。其次，由于动物本身在不同部位会有不同的自发荧光，且不同的激发光条件下，自发荧光也会有明显不同。因此，如果是用小鼠做实验，则尽量选择裸鼠，避免小鼠的皮毛产生的荧光干扰。再者，纳米材料或药物与染料要进行充分的混合，使得药物等充分的包被染料，以提高信号强度，也可防止假阳性的出现。
    最后，活体成像时要设有对照。通过阳性对照确定波谱之后，以此光谱分离的拆分条件对阴性对照组进行拆分，如果条件合适的话，阴性对照应该没有相应的信号。也可根据已有的知识和时间变化来确定信号的部位。
    在使用VILBER Fusion FX7进行活体成像过程中，推荐设置如下：
如果为生物自发光，则选择Chemiluminescence成像模式，设置为f0.84光圈，自动或手动计算最佳曝光时间，也可选择Video模式进行图像连拍以获取最佳成像。

    如果选用荧光染料，则选择Fluorescence成像模式，根据选用的染料选择合适的光源和滤光片，光圈可设定为f1.2，根据信号强弱调节。选择手动模式，根据信号强弱来增加和减少曝光时间。
    成像结束后，还可添加伪彩，以不同的颜色来辨别信号的强弱。
    应用案例：
    以下为青岛大学医学院附属医院与中国海洋大学进行的小鼠体内药物代谢分析实验于VILBER Fusion FX7 Spectra系列成像系统中获得的图像：
    FITC染料代替药物包被纳米材料，以灌胃方式注入小鼠体内，观看不同时间段内药物（信号）在体内的分布情况。以下为灌胃后2h\4h\6h信号的分布情况。