介电泳细胞分析仪

介电泳细胞特性分析仪

3DEP Dielectrophoresis Cell Analysis System

介电泳

DIELECTROPHORESIS

任何物质都有一定的介电特性，在外加电场之下，它们会受到不同程度的极化，而顺着外加电场的方向来排列。如果外加不均匀的电场，极化的微粒会受到介电泳动力（dielectrophoretic force）的影响，造成不同程度的漂移。简而言之，极化（polarizable）的微粒在不均匀（non-uniform）的外加电场中所发生的运动，便称为「介电泳动」。利用不均匀电场来操纵微小物体的介电泳动技术，除了可由交流频率的调控来切换其模式（正、负）之外，介电泳动也具有大量平行处理的潜质，再结合光学微影技术的运用，让单一芯片上具备许多独立操作的微孔槽，而每一微孔槽都可经由介电泳动的机制来操纵微小粒子。这即是微介电泳槽技术（DEP-Well Technology）的基础。

细胞在不均匀的电场中会因频率的不同而改变被极化的状态，当细胞被极化后往高电场的方向移动时称为positive-DEP（上图）；若往低电场的方向移动则为negative-DEP（下图）

微介电泳槽技术

DEP-WELL TECHNOLOGY

微介电泳槽技术乃是将不均匀电场设计在3D的微小孔槽中，并可将细胞直接置于微小孔中进行介电泳动分析的一种专利技术。

3DEP使用专利的微孔芯片，芯片上的20个微孔壁都由正负交错的电极所构成以形成不均匀电场；20个孔洞中之每一微孔（装载约1000个细胞）于实验时会同时给与不同的频率（10k~20M-Hz）使细胞有不同程度的极化，再由摄像机来辨别孔洞的明暗度变化，以量化样本的介电泳强度；当DEP-negative时细胞会被推挤到孔洞中间，拍照时暗度提升，当DEP-positive时细胞会被吸附到孔洞壁上，拍照时亮度提升。不同类型的细胞，拥有不同的介电特性，各孔洞的明亮度也会有所不同。

突破性新技术

介电泳技术虽已发展数十年，但由于传统介电泳普遍为2D，需在单一样本内改变频率做数小时以上的观测，且由于能放置细胞数量少，导致实验变异性大，跨入门坎高。

3DEP整合了微电极微孔槽芯片、光学感应侦测系统、自动信号撷取系统及自动化分析软件等，将介电泳此一技术首次商品化进入市场；不但操作门槛降低，更有高度的稳定性与再现性，让介电泳细胞分析从理论变成真实可靠的应用。

专利芯片设计

抛弃式的芯片设计让实验之间不会有交叉污染的机会；样本的分析小到病毒微粒，大到心肌细胞都适用，整个实验样本不需标定也不会伤害样本。

实验时20个孔洞同时给与不同频率进行侦测，只需数秒就可得到实验结果，跳脱了过往费时费工的限制；3D孔洞的设计可放入大量的样本，以明暗度的变化来量化DEP-Force，使实验的稳定性与再现性达到可商业化的标准。

自动化分析软件

20个孔洞中的明暗度变化直接换算为DEP-Force，中间省略繁琐的物理公式。由环境导电度与电场强度、大小等参数的固定之下，软件会自动进一步计算出细胞膜导电度（membrane conductance）、细胞膜电容度（membrane capacitance）、细胞质导电度（cytoplasm conductivity）和细胞质介电度（cytoplasm permittivity），让细胞在介电泳下的分析获得更多的信息。

介电泳分析细胞的方式，并不像一般的分子标记侦测细胞的化学性变化，而是侦测细胞的物理性变化，包括有：细胞质离子含量和组成、膜电位、膜的导电性、形态学和表面粗糙度、尺寸和形状的形式。由于各种细胞具有不同的介电特性（导电率、介电常数），当受到某种程度的非均匀交流电场时，会诱发细胞上电荷有不同程度的极化现象，细胞将因其不同的介电特性而受到正或负的介电泳力，在此力的作用下会移动到不均匀电场的特定位置，利用此特性即可鉴别不同介电特性的细胞，如肿瘤细胞与正常细胞的介电特性有显著的差异。再由于此法不会破坏细胞且适合微小化，目前已成功应用于分离水中细菌、酵母菌细胞，且能分辨出血液中之癌症细胞及红血球细胞。

干细胞分化潜质的早期鉴定

若在干细胞分化之前就可判断其偏好分化的方向，将可协助未来干细胞的挑选和临床应用。

此研究使用已经确认会分化为Neural-Cells的SC27与确认会分化为Astrocytes的SC23人类神经干细胞进行测试分析。

分化前两细胞不论是型态与marker表现都几乎一致，无法以现行方法分辨。但介电泳实验则可证实两个样本在membrane-capacitance有显著差异，表示两样本之间细胞膜的介电特性有所差异，虽然从图像上无法分辨，但以介电泳侦测方式则可看出端倪；且不论在人类与小鼠和不同细胞代数之间都获得一致的结果。因此遵循此标准，未来将可在早期就判定此神经干细胞分化的趋向。

Biophysical characteristics reveal neural stem cell differentiation potential.

H. Labeed et al，PLoS One.2011.

细胞早期癌化的侦测

目前许多癌症由于发现时已是末期，因此治愈机率相对降低，若能提早发现并治疗将可大幅降低死亡率，可惜的是目前许多分子诊断的方式也难以早期发现正常细胞转化成癌症细胞的征状。

使用human oral keratinocytes（HOK）、dysplastic oral-keratinocytes（DOK）及oral squamous cell carcinomas（H357，H157）进行细胞物理性质的分析。结果发现随着细胞恶性的程度增加，其Effective Membrane Capacitance逐渐上升，代表其细胞膜的完整性降低；同时Cytoplasmic Conductivity逐渐下降，表示其细胞质内的导电度下降。借此方式，可从病人口腔直接收集样本，进行早期的分析诊断。

Cancer, pre-cancer and normal oral cells distinguished by dielectrophoresis.
H.J. Mulhall et al, Anal Bioanal Chem. 2011.

细菌抗药性快速检测

近来具有抗药性的细菌感染逐年增加，因此快速评价抗生素是否具有杀死细菌的效果就变得相当重要。但传统的纸锭扩散试验（Disk diffusion test）大约需要24小时，在测试结果出来之前，病人仍处在危险之中。

以E. coli为例，加入40-μg/mL-polymyxin-B，在一小时及两小时后可观察到E. coli的细胞膜导电度（Gspec）与电容度（Cspec）有相当程度的上升，而细胞质导电度（σcyto）则是明显的下降；此结果表示此抗生素造成E. coli细胞膜严重的破损，进一步使得细胞质内的离子渗漏出来。此测试方式不但可在数秒之内就知道抗生素对细菌的效果，且敏感性与稳定性也相当可靠。

Rapid determination of antibiotic resistance in E. coli using dielectrophoresis.
K.F. Hoettges et al, Phys Med Biol. 2007.

药物毒性评价

药物剂量与细胞存活率的关联性是评价药物使用浓度的重点，快速而又准确的定量药物毒性将可大幅缩短实验时间。由于药物处理后，细胞膜形态与胞内离子浓度的变化比生化标志的出现更为快速，因此可以利用介电泳技术快速评价药物对细胞的反应（图A）。

使用Doxorubicin药物处理K562细胞4小时后，即可使用介电泳技术观察细胞死亡情形（白色柱状），且此结果与传统利用Trypan-blue的方法一致（灰色柱状图），不同之处在于Trypan-blue需在药物处理72小时后才有反应，若处理4小时则无法分辨差异（黑色柱状图）（图B）。此现象反映在不同的细胞株中，表示此技术可用来快速评价药物毒性。

应用范畴

DEP-Well-技术应用领域极为广泛，由于不同生理状态的细胞或细菌，其介电特性皆不同，因此可用来检测干细胞分化能力、细胞凋亡、分辨正常细胞与肿瘤细胞、分辨血液中之癌症细胞（Circulation Tumor Cell，CTC）与红血球细胞、检测细菌种类与抗药性等，极适合用在药物毒性测试与口腔癌检测。