G5U Plus High-Fidelity DNA Polymerase, 由HaiGene分子酶进化平台(in silico Design & invitro Evolution Workflow)筛选获得,
其融合Q5和Q5U DNA聚合酶的性能于一体,使其成为一酶多用的全能选手。G5U Plus DNA聚合酶来源于高保真DNA聚合酶,
并加入了增强的延伸结构,使其具有长片段扩增、高产、快速扩增能力。强压力筛选的外切活性区域,使其具有超保真性能
(与Q5同水平),底物活性中心的改造,使其具有dUTP渗入的能力和扩增含尿嘧啶模板的能力。 G5U Plus DNA聚合酶具有4kb/min以
上的延伸速度,可轻松扩增8kb的基因组DNA、20kb的λDNA。该酶具有5’-3’的聚合酶活性、强3’-5’的外切酶活产物为平末端。
许多具有高保真扩增性能的聚合酶来为 B型 DNA 聚合酶,在遇到 DNA 模板中的尿嘧啶碱基时停止复制。 G5U Plus删除了尿嘧啶结合域
,使其能够读取和扩增含有尿嘧啶的模板,该性能赋予其独特的“U” 特征。该特征有两个重要的应用方向:
(1)用于超保真扩增重亚硫酸氢盐转化、脱氨基、或受损 DNA;(2)在超保真扩增中搭配dUTP和热敏UDG,用于防止 PCR 体系中
携带污染。此外,也多用于USER 克隆。
HotStart G5U Plus DNA聚合酶是具有热启动功能的版本,由独特适配体封闭酶活性中心,在反应结束恢复室温后,适配体可逆的重新
封闭聚合酶。其热启动功能确保在25℃以下无活性,高于50℃后迅速恢复100%活性。热启动功能便于室温建立反应体系、
有效的降低低温下的非特异扩增、提高多重超保真扩增效果,使超保真扩增达到最佳。
主要特征
超保真扩增:与Q5 DNA聚合酶同水平的保真性能,是载体构建、点突变、NGS模板扩增、基因合成的最佳用酶。
识别dUTP底物:能够读取和扩增含有尿嘧啶的模板,具有“U” 特征。
防污染扩增:在PCR扩增中可以使用dUTP完全替代dTTP,建立防污染高保真扩增。
快速扩增:具有4kb/min的扩增能力。
长片段扩增:质粒、λDNA 等简单模板>20 kb,复杂基因组模板>8 kb。
单位定义
一个活力单位即在72°C条件下,30分钟内催化10 nmol dNTP的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量。
储存
(1)酶储存液:10mM Tris-HCl,pH7.6,100mM NaCl,0.05% Tween20, 1mM DTT,0.5mM EDTA,50%甘油。
(2)置于-20°C以下,可保存3年。
应用实例1:在以A3824-03或 A3828-03,用 LP1002引物组进行的LAMP测试。Bst4.0 SYBR Green试剂可在标准定量PCR仪或恒温荧光仪上进行反应。以体外转录RNA为模板,1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6Copies,NTC为ddH2O为模板。下图为65℃反应25min的检测结果,可以看到检测反应<20min(达平台期)。
应用实例2: 用 LP1002引物组进行的LAMP测试。OG变色法为终点变色策略,在反应结束后,倒置反应管,溶解管盖上染料后,阳性样本呈现出醒目的绿色,阴性表现出橙色,区分明显。且该方法不受样本类型限制,杂质耐受性很好。以体外转录RNA为模板,1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6Copies,NTC为ddH2O为模板。下图为65℃反应20min后检测结果。
应用实例3:采用荧光酶活测定法在30℃和60℃条件下测定HotStart Bst 4.2,结果显示与未加入Aptamer的对照比较来看。HotStart Bst 4.2在30℃条件下酶活几乎无活性,而60℃条件下1min内酶活完全释放,恢复100%活性