获取电话丙酮酸脱羧酶（PDC）测试盒 微量法/紫外分光光度法
注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水
试剂组成和配制:
试剂一:液体 100mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:液体 20mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:液体 1.5mL×1 支,-20℃保存;
试剂四:液体 28mL×1 瓶,4℃保存;
试剂五:粉剂×1 瓶,4℃保存;
试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存,临用前加入 1.2mL 蒸馏水,用不完的试剂仍-20℃保存;
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
①称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
②将匀浆 600g,4℃离心 5min。
③弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。
④上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的 CS(此步可选做)。
⑤在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3秒,间隔 10 秒,重复 30 次),用于线粒体 CS 测定。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 412nm,蒸馏水调零。
2、样本测定
(1)在试剂五中加入 0.6mL 无水乙醇和 13mL 试剂四,混匀,37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
(2)测定管:在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、220μL 试剂五和 10μL 试剂六,混匀,37℃反应 15min 后立即测定吸光值 A1。
(3)对照管:在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、220μL 试剂四和 10μL 试剂六,混匀,37℃反应 15min 后立即测定吸光值 A2。(4)计算 ΔA=A1-A2,每个测定管设一个对照管。
