获取电话微量法 100 管/48 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循环(TCA)的主要氢受体,生成的 NADH
经呼吸电子链(ETC)传递把电子交给氧,在合成 ATP 的同时,形成大量的 ROS,同时 NADH 再生为
NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和
TCA 循环的强弱。较高的
NAD(H)及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高,处于过氧化状态。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和
TCA循环。另外,NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。
测定原理
分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD+和 NADH,NADH 通过 PMS 的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒,在 570nm 下检测吸光值;而 NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH,进一步采用 MTT 还原法检测。
需自备的仪器和用品
酶标仪、台式离心机、移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
酸性提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;
碱性提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 10 mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:液体 3 mL×1 瓶,4℃保存;
试剂三:粉剂×1 瓶,-20 ℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀,用不完的试剂 4℃保存一周;
试剂四:粉剂×1 瓶,4 ℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀,用不完的试剂 4℃保存一周;
试剂五:液体 3.6mL×1 瓶,4 ℃保存;
试剂六:液体 30mL×1 瓶,4 ℃保存;
试剂七:液体 50mL×1 瓶,4 ℃保存。
NAD+和 NADH 的提取
1 血清(浆)中 NAD+和 NADH 的提取
NAD+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建 议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失); 冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中 和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
NADH 的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建 议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 碱性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失); 冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中 和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2 组织中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10
的比例(建议取约 0.1g组织,加入 1mL 酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4
℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心
10min,取上清,置冰上待测。
NADH
的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g组织,加入 1mL
碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL
上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3 细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):酸性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议
500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液),超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30
次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL
碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
NADH 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104
个):碱性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液),超声波破碎(冰浴,功率
20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4
℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心
10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 570nm,蒸馏水调零。
2、 加样表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加样):
注意事项
1、如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。
2、对照管和测定管的测定步骤的区别:对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六;测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。
3、反应过程中注意避光。
4、若 NAD+测定中△A(A2-A1)≤0.0302,NADH 测定中△A(A2-A1)≤0.0222,说明样本中辅酶含量较低,已低于检测限,可做如下调整:(1)将测定管避光静置时间 20min延长到 60min;(2)在提取阶段增加取样量,即取 0.2g 样本或 0.2mL 样本加入 1mL 提取液。
5、由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒 100 管保证测 48 个 NAD+或 NADH.
