[样品制备]
处理实体组织时,使用手动方法或解离剂和组织解离试剂盒制备单细胞悬液。
▲ 注意:死细胞可能与微珠非特异性结合。要去除死细胞,我们建议使用密度梯度离心或死细胞去除试剂盒。
由于克隆 293C3 和其他克隆的表位在大多数肿瘤组织中不与克隆 AC133 的表位共表达,因此请勿将其用于评估细胞分离。由于大多数细胞的表达水平低,因此也不可能使用AC133荧光染料偶联物对已经微珠标记的细胞进行荧光染色。为了通过流式细胞术或荧光显微镜评估MACS分离,请使用与PE等偶联的标记检查试剂。
[磁性标签]
▲ 快速工作,保持细胞低温,并使用预冷溶液。这将防止抗体在细胞表面封顶和非特异性细胞标记。
▲ 下面给出的磁性贴标体积最多为107总细胞数。使用少于 10 个时7单元格,使用与指示相同的体积。当使用较高数量的细胞时,相应地扩大所有试剂体积和总体积(例如,2×107总细胞数,使用所有指示试剂体积和总体积的两倍)。
▲ 为了获得最佳性能,在磁分离之前获得单细胞悬液非常重要。将细胞通过30μm尼龙网(预分离过滤器)以去除可能堵塞色谱柱的细胞团块。使用前用缓冲液润湿过滤器。
1. 确定细胞数。
2.将细胞悬液以300×g离心10分钟。完全吸出上清液。
3. 将细胞沉淀重悬于每 60 次 10 μL 缓冲液中7总细胞数。
4. 每 20⁷ 个总细胞加入 10 μL FcR 封闭试剂。
5. 每 20⁷ 个总细胞加入 133 μL CD10 微珠 – 肿瘤组织。
▲ 推荐孵育温度为2-8°C。 更高的温度和/或更长的孵育时间可能导致非特异性细胞标记。在冰上工作可能需要增加孵育时间。
6.充分混合,并使用管旋转器在冰箱(15-2°C)中缓慢连续旋转孵育8分钟。
7. 每 1 次加入 2-10 mL 缓冲液洗涤细胞7细胞并以300×g离心10分钟。完全移取上清液。
8.(可选)加入染色抗体,例如10μL标记检查试剂-PE,充分混合,并在冰箱(5-2°C)中在黑暗中孵育8分钟。
▲ 注意:标记检查试剂可确保对分离的CD133细胞进行最佳的流式细胞术分析。+
9.(可选)每 1⁷ 个细胞加入 2-10 mL 缓冲液,并以 300×g 离心 10 分钟,洗涤细胞。完全吸出上清液。
10. 在 10 μL 缓冲液中重悬多达 500⁷ 个细胞。
▲ 注意:对于更高的细胞数量,请相应地增加缓冲液体积。
11. 进行磁选。
[磁选]
▲ 根据总细胞数和CD133细胞数选择合适的MACS色谱柱和MACS分离器。+
▲ 始终等到色谱柱储液槽为空后再进行下一步。
使用 MS 或 LS 色谱柱进行磁分离
1. 将色谱柱置于合适的 MACS 分离器的磁场中。
2.用适量的缓冲液冲洗制备色谱柱:
质谱:500 微升 LS:3 毫升
3.将细胞悬液涂在色谱柱上。收集含有未标记细胞的流通物。
4.用适量的缓冲液洗涤色谱柱。收集通过并与步骤3中的流出物结合的未标记细胞。
质谱:3× 500 μL LS:3× 3 mL
▲ 注意:仅当色谱柱储液槽为空时,才通过添加缓冲液等分试样来执行洗涤步骤。
5.从分离器中取出色谱柱并将其放在合适的收集管上。
6. 将适量的缓冲液移液到色谱柱上。通过将柱塞牢固地推入色谱柱中,立即用磁性标记的细胞冲洗出馏分。
质谱:1 毫升 LS:5 毫升
7.为了提高CD133细胞的纯度,请在第二根MS或LS色谱柱上富集洗脱级分。使用新色谱柱重复步骤1至6中所述的磁性分离过程。+
LD色谱柱的耗尽
1. 将LD柱放置在合适的MACS分离器的磁场中。
2. 用 2 mL 缓冲液冲洗制备色谱柱。
3.将细胞悬液涂在色谱柱上。
4.收集通过的未标记细胞并用2×1 mL缓冲液洗涤色谱柱。收集总流出量;这是未标记的细胞部分。通过添加缓冲液两次来执行洗涤步骤。仅当色谱柱储液槽为空时才添加新缓冲液。
使用 autoMACS 分离器进行磁分离
1.准备并启动分离器。
2.应用含有样品的试管,并提供用于收集标记和未标记细胞组分的管。将样品管放在摄取端口处,将馏分收集管放在端口neg1和端口pos2处。
3. 对于标准分离,请选择以下程序之一:
正选择:波塞尔德2。
从出口端口 pos2 收集正分数。
耗尽:耗尽。
从出口端口 neg1 收集负分数。