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其他参数
rProtein A/G 琼脂糖填料
rProtein A/G Beads 4FF
产品规格: 5ml / 25ml / 100ml
产品介绍:
rProtein A/G 琼脂糖填料 (rProtein A/G Beads 4FF) 是由高质量的 Recombination Protein A/G 高密度定向偶联到高度 交联的琼脂糖凝胶微球表面,该产品具有更高的抗体结合能力和较低的蛋白非特异吸附率,一步纯化即可从血清样品中分离 出纯度大于 90%的抗体,操作简便高效。
本产品主要用于免疫沉淀(IP)以及免疫共沉淀(Co-IP)研究,也可用于抗体固定及其它相关研究。用户可根据目标抗体的 种属来源及亚型选择微球的类别,Protein A,Protein G 和 Protein A/G 与不同抗体的亲和性比较参见表 2。
rProtein A/G 琼脂糖填料性能参数:
操作流程:
缓冲液准备
所用水和缓冲液在使用之前建议用 0.22μm 或 0.45μm 滤膜过滤。
平衡/洗液:0.15M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH 7.0
洗脱液:0.1M 甘氨酸,pH 3.0
中和液:1M Tris-HCl,pH8.5
交联液:0.2 M 三乙醇胺, pH 8.2
交联剂:DMP (dimetylpimelimidate dihydrochloride) (20 mM DMP 需要现用现配)
终止液:50 mM Tris, pH 7.5
一、免疫沉淀 (Immunoprecipitation,IP):
1. 蛋白样品的准备:
(1) 贴壁细胞:取 10 cm 细胞培养皿中的贴壁细胞,吸除细胞培养液,PBS 洗涤 2 次,然后加入 500 µl 至 2 ml细胞裂解液裂解细胞(如 RIPA 裂解液);
(2) 悬浮细胞:离心收集细胞后,PBS 洗涤 1 次,然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解;
(3) 动植物组织样本:参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解;
注:a. 具体的裂解方法,应参考不同裂解液的详细使用说明;b. 不同量的细胞,应选用适当裂解液的用量进行裂解(如果裂解获得的蛋白样品浓度过高,可以用裂解液或 PBS 适当稀释,如果蛋白样品浓度过低,在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量),通常裂解液最终总蛋白浓度选择在 0.5-1ug/ul 范围内较合适;c. 可选:细胞或组织处理时加入广谱核酸酶 Benzonase,能够降解所有形式的 DNA 和 RNA(单链、双链、线形和环状),而无蛋白水解活性。此步操作可以降低背景,保障实验的可重复性。
2. 去除非特应性结合(可选):
(1) 取 0.2-1 ml 细胞或组织裂解液,蛋白量约为 0.2-1 mg,加入约 1 µg 和免疫沉淀时使用的 IgG 种属相同的普通 IgG 和 20 µl 充分重悬的 Protein A/G Agarose Resin 4FF,4℃缓慢摇动 30 min~2 h。
(2) 2500 rpm(约 1000g)离心 5min,取上清用于后续的免疫沉淀。
注:所谓种属相同的 IgG 是指与后续免疫沉淀用一抗宿主相同的正常 IgG。此步骤可以预先去除样本与 Protein A/G Agarose Resin 4FF 的非特异性结合,降低背景。
3. 免疫沉淀:
(1) 抗体吸附
① 取适量 Protein A/G Agarose Resin 4FF 加入到 2ml 离心管中,500rpm 离心 1min,吸弃上清。
② 加入 0.5ml 结合缓冲液重悬树脂,500rpm 离心 1min,吸弃上清。继续重复 2 次此操作。
③ 向上述已平衡树脂中加入抗体溶液,重悬树脂,室温下轻轻翻转离心管或置于翻转混合仪混匀 30min 后,500rpm 离心 1min,收集上清液,备用,待检测。
④ 向上述树脂中加入 0.5ml 的洗杂缓冲液,重悬树脂对其进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋白,500rpm 离心1min,吸弃上清。再重复 2 次。
(2) 抗体交联(可选)
注:如需将抗体和目标抗原复合物共同洗脱,请忽略此步骤。
① 向清洗过的树脂中加入 1ml 交联 Buffer,500rpm 离心 1min,吸弃上清。
② 再向其中加入 1ml 20mM DMP(Dimetyl pimelimidate dihydrochloride)的交联 Buffer,该试剂需现配现用,重悬树脂,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转,促使 Buffer 和树脂充分接触,30min 后,500rpm 离心 1min,吸弃上清。
③ 再向其中加入 1ml 终止液,重悬树脂,终止交联反应,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转15min,500rpm 离心 1min,吸弃上清。
④ 加入 0.5ml 洗杂缓冲液,重悬树脂,进行清洗,500rpm 离心 1min,吸弃上清。再重复 2 次。
(3) 沉淀反应
① 抗原吸附:向上述树脂-抗体溶液中加入含抗原的样品,用移液器轻轻吹打使抗原与树脂-抗体复合物分散均匀,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转 10min,使抗原与抗体充分结合,如结合力较弱则可在室温下反应 1h 或者在 4℃下反应过夜。
② 洗杂:将上述完成抗原吸附的产物 500rpm 离心 1min,收集上清液置于冰上待检测。向离心管中加入 1ml 洗杂缓冲液,用移液器轻轻吹打使树脂-抗体-抗原复合物分散均匀,500 rpm 离心 1min,弃上清。重复 2 次,最后加入 1ml 洗杂液,将树脂-抗体-抗原复合物转移至新的离心管中,500 rpm 离心 1min,吸弃上清。
4. 样品洗脱
注:根据后续检测的不同提供两种洗脱方法。
(1) 变性洗脱:该方法适于 SDS-PAGE 检测。向上述离心管中加入 25µl 1×SDS-PAGE loading buffer 混匀,95℃加热 5min。500rpm 离心 1min,收集上清进行后续 WB 分析。
(2) 非变性洗脱:该法洗脱的样品保持原有的生物活性,可用于后续功能分析。具体做法:向上述沉淀反应得到的树脂-抗体-抗原复合物中加入 5 倍体积的洗脱 Buffer,用移液器轻轻吹打数次,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转 10min,500rpm 离心 1min,吸取上清,收集洗脱组分,即为目标抗原,将其收集至新的离心管中,立即加入 1/10 体积的中和液,将洗脱组分 PH 调至 7.0-8.0,备用。
二、免疫共沉淀 (Co-IP)
1. 抗原抗体的结合:
将抗体与含有目的蛋白的裂解液混合,室温孵育 30-60min,或者 4℃孵育过夜。
注:① 该步骤孵育时间取决于抗原与抗体的结合效率以及抗原的稳定性,需根据具体情况进行优化;② 抗体的加入量需参考后续加入树脂的量,抗体加入量过多会导致抗原-抗体混合物与树脂的结合。推荐抗体加入量为树脂最大载量的 80%为宜。
2. 树脂准备:
(1) 取适量 Protein A/G Agarose Resin 4FF 加入到 2ml 离心管中,500rpm 离心 1min,吸弃上清。
(2) 加入 0.5ml 结合 Buffer 重悬树脂,500rpm 离心 1min,吸弃上清。继续重复 2 次此操作。
3. 抗原-抗体混合物的吸附:将步骤 1 中抗原-抗体混合物加入到已处理的树脂中,混匀,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转 30min,使其充分接触并吸附,500rpm 离心 1min,收集上清留待检测。
4. 洗杂:向上述离心管中加入 0.5ml 洗杂缓冲液,重悬树脂,去除非特异性结合,500rpm 离心 1min,吸弃上清。再重复 2 次此操作。
5. 抗原洗脱(根据后续检测的目的提供两种抗原洗脱方法,同免疫沉淀法洗脱)
注意事项:
1. 请勿冷冻保存本产品。
2. Protein A/G 琼脂糖珠使用前一定要充分颠倒若干次,使琼脂糖珠混合均匀。
3. 所有操作过程中,样本需要在 4℃或冰上操作。
4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!