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- 保存条件:2-8℃
蛋白免疫印迹（Western Blot）试剂盒（抗小鼠）
产品规格:36T
产品描述：在 Western 印迹法中，待测样品溶解于去污剂和还原剂的溶液中，经过 SDS 聚丙烯 酰胺凝胶电泳后转移到固相支持物上(常用硝酸纤维滤膜)，可被染色，随后滤膜可与抗靶蛋白一抗反应。最 后，特异性结合抗体可用多种二级免疫学试剂(与辣根过氧化物酶 HRP 或碱性磷酸酶 AP 或荧光标记)进行 显色检测。
产品内容：
注：各组分试剂瓶打开后 2-8℃保存一周。
注：NC 膜（5K-5）默认发 0.45um 孔径的，如需孔径 0.2um 的 NC 膜，请单独备注
自备材料：
1. 适合目的蛋白浓度的凝胶板，可购买（SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒）；
2. 电泳仪及相关设备；
3. 电转仪及相关设备；
4. 抗体孵育相关仪器；
5. 高精度可调移液器（已校准）及吸头：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl。
6. 甲醇
样品处理：
取样---裂解组织或细胞---低温、高速离心管得上清---BCA 测浓度---稀释到一致浓度---添加 2×上样缓冲液
（样品：2×上样缓冲液=1:1）---蛋白样品变性。
溶液配制：
⚫ 电泳缓冲液：取 10×电泳液 100ml，加入双蒸水，定容至 1000ml。
⚫ 电转缓冲液：取 10×电转液 100ml，加 200ml 无水甲醇，加入双蒸水，定容至 1000ml。
⚫ 1×TBST：取 10×TBST 溶液 100ml，加入双蒸水，定容至 1000ml。
操作步骤：
1．样品：取准备好的蛋白裂解液，和 2×上样缓冲液等体积混合，混匀后于 100 度煮 10min，12000rpm 离心 5min，取适量体积上样。
2. 电泳：使用配制好的电泳液，80V 电泳 20min，120V 电泳至结束。
3. 转膜：使用配制好的电转液，100V 恒压电转 90min。
4. 封闭：用 1×TBST 配制 5%的脱脂奶粉/BSA 溶液，将膜置于 5%的脱脂奶 粉/BSA 溶液中，室温摇床上孵育 60min。
5. 孵育一抗：5%脱脂奶粉/BSA 稀释一抗，条件为 2-8 度摇床上孵育过夜。
6. 洗涤：用 1×TBST 洗 3 次，每次 10min。
7. 孵育二抗：5%脱脂奶粉/BSA 稀释二抗，条件为室温摇床上孵育 60min。
8. 洗涤：用 1×TBST 洗 3 次，每次 10min。
9. 显色和曝光：取显色 A 液和 B 液等体积混合，将混合后的液体铺满整张膜，反应 2min，之后即可进行曝光操作。
常见问题分析及解决方法：
注意事项：
1. 组织、细胞蛋白样品的上样量为 20-40ug，但是纯蛋白上样量为 4ug 左右。
2. 电极不平衡或加样操作偏斜会导致条带向两边扩散。
3. 叠氮钠是一种 HRP 的抑制剂，使用 HRP 标记的二抗时，缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂。
4. 转膜时一定要先将 NC 膜用转膜缓冲液完全浸透，防止转膜时有气泡产生。
5. 转膜过程中，需保持转膜缓冲液低温，最好在缓冲液中放冰袋降温，防止高温致蛋白条带变形。
6. 转膜时注意方向，胶靠近在负极，膜靠近正极。
7. 封闭时，生物素标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生物素，用 BSA 效果更好，磷酸化抗体检测应使用 BSA 封闭。
8. 一抗与二抗孵育时应放置摇床，孵育均匀，防止出现条带不一致现象。
特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
