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Annexin V-AF488细胞凋亡检测试剂盒
产品规格:100T
产品介绍:
磷脂酰丝氨酸(PS)是一种带负电荷的磷脂,正常细胞中,PS 只分布在细胞膜脂质双层内 侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜 PS 由脂膜内侧翻向细胞膜外侧,使 PS 暴露在细胞膜外表面。Annexin V 是一种分子量为 35~36kD 的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外 侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此 Annexin V 被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指 标之一。
将 Annexin V 进行 AF488 标记,以标记了的 Annexin V 作为探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检 测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过正常细胞或早期凋亡 细胞完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞,PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此采用 Annexin V 与 PI 双染的方法,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
试剂盒组份:
所需实验器材和试剂:
1. 胰酶(不含 EDTA)
2. PBS
3. 微量移液器
4. 低速离心机
5. 流式细胞仪
操作说明:
1. 样品染色
(1).悬浮细胞:300g,4℃离心 5min 收集细胞。
贴壁细胞:用不含 EDTA 的胰酶消化后,300g,4℃离心 5min 收集细胞。胰酶消化时间不宜过长,
以防引起假阳性。
(2). 用预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次,每次均需 300g,4℃离心 5min,收集 1~5×105个细胞。
(3). 吸弃 PBS,加入 100ul 1×Binding Buffer 重悬细胞。
(4). 加入 5ul Annexin V-AF488 和 5ul PI Staining Solution,轻轻混匀。
(5). 室温避光孵育 10-15min。
(6). 加入 400ul 1×Binding Buffer,混匀后放置于冰上,样品在 1 小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
2. 样品分析
A.流式细胞仪分析:
AF488 最大激发波长为 488nm,最大发射波长 519nm;PI-DNA 复合物的最大激发波长为 535nm,最大发射波长为 615nm。用 CellQuest 等软件进行分析,绘制散点图,AF488 为横坐标,PI 为纵坐标。典型实验中的细胞可以分成三个亚群,活细胞仅有很低强度的自发荧光,早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光,晚期凋亡细胞有绿色及红色荧光双重染色。
图 2. 流式细胞仪检测早期凋亡细胞。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,右下象限为早期凋亡细胞,右上象限是凋亡晚期细胞和坏死细胞。
B.荧光显微镜分析:
(1). 悬浮细胞:滴一滴用 AnnexinV-AF488/PI 双染的细胞悬液于载玻片上,并用盖玻片盖上细胞。
贴壁细胞:可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。
(2). 在荧光显微镜下用双色滤光片观察。早期凋亡细胞仅有绿色荧光信号,晚期凋亡细胞有绿色及红色荧光双重染色。
注意事项:
1. 此试剂盒仅供研究使用。
2. 微量试剂需离心数秒将试剂收集至管底后再开盖取用。
3. Propidium Iodide(PI)有毒,操作时要带手套,使用时避免与皮肤,眼睛和黏膜接触。
4. Annexin V-AF488中含有毒性成分叠氮化钠(NaN3), 操作时要带手套,使用时避免与皮肤,眼睛和黏膜接触。
5. 本试剂盒用于检测活细胞,流式细胞仪检测时,细胞数量不应低于1×105个。
6. 染色后宜尽快检测,时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
7. 对于贴壁细胞,由于胰酶消化会造成细胞膜的损伤,从而导致较高的假阳性;用细胞刮会造成细胞粘连成团,从而影响检测。
8. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭,请不要固定样品。
运输与保存方法
冰袋运输,-20℃避光保存,有效期一年;如需在短时间内多次重复使用,可4℃避光保存,半年有效。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!