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鼠肺炎病毒RT-PCR试剂盒
【产品名称】
英文名称:Pneumonia Virus of Mice RT-PCR Kit
中文名称:鼠肺炎病毒RT-PCR试剂盒
【包装规格】
50T/盒
【预期用途】
本公司开发了本产品,可用于在科研领域快速定量检测鼠肺炎病毒。它具有下列特点:
1. 一站式,用户不需要单独准备每种成分,包括引物和对照。
2. 根据鼠肺炎病毒的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性。
3. 灵敏度可以达到 1000 拷贝/反应。
4. 使用一管式 RT-PCR 技术,RT 和 PCR 两步在一个试管内完成,不需要中间转移样品,降低了操作误差和可能的污染。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的 RT-PCR。
6. 本产品只能用于科研,不能用于临床。
【检验原理】
本试剂盒采用RT-PCR技术,针对鼠肺炎病毒的基因高度保守区域设计特异性引物,用RT-PCR 技术对鼠肺炎病毒的核酸进行体外扩增检测,在反应体系中含鼠肺炎病毒核酸模板的情况下,RT-PCR反应进行特异性扩增,利用琼脂糖凝胶电泳技术对RT-PCR扩增产物进行检测,依据特异性扩增片段的结果,判断待检样品中是否含有鼠肺炎病毒成分,实现检测结果的定性分析。
【试剂组成】
名称 | 规格 |
5×双酶一管式 RT-PCR Buffer | 200μL×1管 |
MMLV-Taq Mix | 75μL×1管 |
超纯水 | 1mL×1管 |
鼠肺炎病毒RT-PCR引物混合液 | 100μL×1管 |
鼠肺炎病毒RT-PCR阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL) | 50μL×1管 |
核酸释放剂 | 20 次1mL×1管 |
使用手册 | 一份 |
注:为避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供专一的DNA 片段作为阳性对照。
【储存条件及有效期】
低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。收到货后阳性对照需要跟其他成分分开放置,因为其容易污染其他成分,造成假阳性。
【自备试剂】
样品 RNA。
【样品RNA的制备】
1. 如果有 N 个样品,必须设置N+2个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL鼠肺炎病毒PCR阳性对照的10000倍稀释的(稀释后浓度为1×10E4 拷贝/μL,10μL 相当于1万拷贝,可以将10μL原液加入到990μL自备TE溶液中,充分混匀,此为100倍稀释液。再取10μL此稀释液加入到990μL自备TE溶液中,充分混匀,此为10000倍稀释液)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 RNA。
2. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。
【设置 RT-PCR 反应(20μL 体系】
3. 如果有N+2个样品,则标记N+4个PCR管(额外增加的两个管一个是RT-PCR阳性对照,另一个是RT-PCR阴性对照)并按照下表在PCR管中加入下列成分:
成份 | N+2 个样品管 | RT-PCR阴性对照 | RT-PCR阳性对照 |
5×双酶一管式RT-PCR Buffer | 各4μL | 4μL | 4μL |
鼠肺炎病毒RT-PCR引物混合液 | 各2μL | 2μL | 2μL |
N+2个制备的RNA样品 | 各12.5μL | 不加 | 不加 |
超纯水 | 不加 | 12.5μL | 不加 |
鼠肺炎病毒RT-PCR阳性对照的10000倍稀释液 | 不加 | 不加 | 12.5μL |
MMLV-Taq Mix | 1.5μL | 1.5μL | 1.5μL |
4. 上机进行 RT-PCR,RT-PCR 反应参数为:
5. 琼脂糖电泳检测扩增效果,阳性样品预期得到的扩增产物长度为 720bp。如果阴性对照有此扩增产物或阳性对照无此扩增产物,则说明实验失败,需要分析实验失败的原因。只有在阴性对照没有此扩增产物、阳性对照有此扩增产物的情况下,才有必要分析样品的实验结果,如果有此扩增产物则为阳性,如果无则为阴性。
6. 检测方法的局限性
Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
Ø 阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
Ø 不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
Ø 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果。
7. 注意事项
Ø 所有操作严格按照说明书进行;
Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,混匀并短暂离心;
Ø 反应液应避光保存;
Ø 反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
Ø 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
Ø 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!