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获取电话传染性造血器官坏死病病毒RT-PCR试剂盒
【产品名称】
英文名称：Infectious Hematopoietic Necrosis Virus(IHNV) RT-PCR Kit
中文名称：传染性造血器官坏死病病毒RT-PCR试剂盒
【包装规格】
50T/盒
【预期用途】
传染性造血器官坏死病病毒(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus,IHNV)是一种 RNA 病毒，多传染鱼类，引起鱼传染性造血器官坏死病，是一种毒力很强的弹状病毒所引起的急性、全身性的严重传染病，常发生于鳟鱼和太平洋大马哈鱼的鱼苗和种鱼。鱼传染性造血器官坏死病爆发时，首先出现稚鱼和幼鱼的死亡率突然升高。受侵害的鱼通常出现昏睡症状，不愿活动和避开水流；但也有的鱼表现狂暴乱窜、打转等反常现象。患病鱼眼球突出且变黑，腹部膨胀，肛门处拖着不透明或棕褐色的假管型粘液粪便是较为典型的特征，但并非该病所独有。鱼鳃苍白，鳍基部出血，该病的发生会给养殖业造成较大的经济损失，因此传染性造血器官坏死病病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。为此本公司开发了本产品，可用于在科研领域快速定量检测传染性造血器官坏死病病毒。它具有下列特点：
1. 一站式，用户不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
2. 根据传染性造血器官坏死病病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
3. 灵敏度可以达到 1000 拷贝/反应。
4. 使用一管式 RT-PCR 技术，RT 和 PCR 两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的 RT-PCR。
6. 本产品只能用于科研，不能用于临床。
【检验原理】
本试剂盒采用RT-PCR技术，针对传染性造血器官坏死病病毒的基因高度保守区域设计特异性引物，用RT-PCR 技术对传染性造血器官坏死病病毒的核酸进行体外扩增检测，在反应体系中含传染性造血器官坏死病病毒核酸模板的情况下，RT-PCR反应进行特异性扩增，利用琼脂糖凝胶电泳技术对RT-PCR扩增产物进行检测，依据特异性扩增片段的结果，判断待检样品中是否含有传染性造血器官坏死病病毒成分，实现检测结果的定性分析。
【试剂组成】
名称 | 规格 |
5×双酶一管式 RT-PCR Buffer | 200μL×1管 |
MMLV-Taq Mix | 75μL×1管 |
超纯水 | 1mL×1管 |
传染性造血器官坏死病病毒RT-PCR引物混合液 | 100μL×1管 |
传染性造血器官坏死病病毒RT-PCR阳性对照 （1×10E8 拷贝/μL） | 50μL×1管 |
核酸释放剂 | 20 次1mL×1管 |
使用手册 | 一份 |
注：为避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供专一的DNA 片段作为阳性对照。
【储存条件及有效期】
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。收到货后阳性对照需要跟其他成分分开放置，因为其容易污染其他成分，造成假阳性。
【自备试剂】
样品 RNA。
【样品RNA的制备】
1. 如果有 N 个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL传染性造血器官坏死病病毒PCR阳性对照的10000倍稀释的（稀释后浓度为1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于1万拷贝，可以将10μL原液加入到990μL自备TE溶液中，充分混匀，此为100倍稀释液。再取10μL此稀释液加入到990μL自备TE溶液中，充分混匀，此为10000倍稀释液）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 RNA。
2. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。
【设置 RT-PCR 反应（20μL 体系】
3. 如果有N+2个样品，则标记N+4个PCR管（额外增加的两个管一个是RT-PCR阳性对照，另一个是RT-PCR阴性对照）并按照下表在PCR管中加入下列成分：
成份 | N+2 个样品管 | RT-PCR阴性对照 | RT-PCR阳性对照 |
5×双酶一管式RT-PCR Buffer | 各4μL | 4μL | 4μL |
传染性造血器官坏死病病毒RT-PCR引物混合液 | 各2μL | 2μL | 2μL |
N+2个制备的RNA样品 | 各12.5μL | 不加 | 不加 |
超纯水 | 不加 | 12.5μL | 不加 |
传染性造血器官坏死病病毒RT-PCR阳性对照的10000倍稀释液 | 不加 | 不加 | 12.5μL |
MMLV-Taq Mix | 1.5μL | 1.5μL | 1.5μL |
4. 上机进行 RT-PCR，RT-PCR 反应参数为:
5. 琼脂糖电泳检测扩增效果，阳性样品预期得到的扩增产物长度为 720bp。如果阴性对照有此扩增产物或阳性对照无此扩增产物，则说明实验失败，需要分析实验失败的原因。只有在阴性对照没有此扩增产物、阳性对照有此扩增产物的情况下，才有必要分析样品的实验结果，如果有此扩增产物则为阳性，如果无则为阴性。
6. 检测方法的局限性
Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
Ø 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
Ø 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
Ø 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果。
7. 注意事项
Ø 所有操作严格按照说明书进行；
Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，混匀并短暂离心；
Ø 反应液应避光保存；
Ø 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
Ø 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
Ø 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
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