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莫氏立克次体(现名伤寒立克次体)PCR试剂盒
【产品名称】
英文名称:Rickettsia mooseri PCR Kit
中文名称:莫氏立克次体(现名伤寒立克次体)PCR试剂盒
【包装规格】
50T/盒
【预期用途】
地方性斑疹伤寒亦称蚤型或鼠型斑疹伤寒,由莫氏立克次体以鼠蚤为媒介而引起的急性传染病。莫氏立克次体接种雄性豚鼠腹腔后,豚鼠除发热外,阴囊高度水肿,称之为豚鼠阴囊现象。莫氏立克次体在睾丸鞘膜的浆细胞中繁殖甚多,其鞘膜渗出液涂片可查见大量立克次体。莫氏立克次体可引起大白鼠发热或致死,并在其脑内存活数月,故可用之保存菌种或传代;接种于小白鼠腹腔内可引起致死性腹膜炎及败血症。因此对莫氏立克次体进行快速灵敏的诊断具有重要的意义。本产品就是为此目的根据 PCR 原理开发的产品,它具有下列特点:
1. 即开即用,用户只需要提供 DNA 模板。
2. 引物经过精心优化,专一性强,只扩增莫氏立克次体,但跟其他微生物无交叉反应。
3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4. PCR mix 中含上样染料,PCR 后可以直接上样电泳。
5. 本试剂盒足够做 40μL 体系的 PCR 50 次。
6. 本产品只能用于科研。
【检验原理】
本试剂盒采用 PCR 技术,针对莫氏立克次体(现名伤寒立克次体)的基因高度保守区域设计特异性引物,用 PCR 技术对莫氏立克次体(现名伤寒立克次体)的核酸进行体外扩增检测,在反应体系中含莫氏立克次体(现名伤寒立克次体)核酸模板的情况下,PCR 反应进行特异性扩增,利用琼脂糖凝胶电泳技术对 PCR 扩增产物进行检测,依据特异性扩增片段的结果,判断待检样品中是否含有猪细小病毒源性成分,实现检测结果的定性分析。
【试剂组成】
名称 | 规格 |
莫氏立克次体(现名伤寒立克次体)扩增液 | 50μL×1管 |
莫氏立克次体(现名伤寒立克次体)反应液 | 950μL×1管 |
莫氏立克次体(现名伤寒立克次体)阳性质控品 | 50μL×1管 |
莫氏立克次体(现名伤寒立克次体)阴性质控品 | 50μL×1管 |
说明书 | 1份 |
说明:1)不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
2)试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融少于 7 次,有效期 12 个月。
【适用仪器】
无 DNA/RNA 酶的 1.5mL 离心管,0.2mL PCR 反应管,滤芯吸头(规格:10μL,200μL,1000μL),离心机,振荡混合器,各种规格的移液器,琼脂糖,电泳槽,电泳仪,凝胶成像系统。
【样品要求】
1. 根据实际情况可采取食品、粪便、呕吐物、口腔样本,唾液、咽喉部鼻孔眼部和肛门拭子及病毒培养物作为检测样本。
2. 应避免样本间交叉污染,样本采集后应及时检测,也可保存于-20±5℃待检,长期保存应置于-70℃以下。
【样品保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 2~8℃冰袋运输,严禁反复冻融。
【使用方法】
1. 样品处理(样本处理区)
1.1 样本前处理
取悬浮的口腔样本或粪便样本 100ul,加入 1.5ml 离心管中,用 DNA 核酸提取试剂盒进行提取即可。
1.2 DNA 提取
根据您实验室的具体情况和样品类型,选择适当的提取策略方法。为了使实验结果稳定、有效、可靠,我们建议使用商品化的试剂盒进行提取,严格按照对应试剂盒说明书进行操作,样本核酸提取过程中应避免污染,提取好的模板样品如不能立即检测,建议-15℃以下保存。
推荐采用我们公司研发生产的试剂盒:Hypure 病毒基因组 DNA 提取试剂盒(离心柱法)
2. 试剂配制(试剂准备区)
2.1 从-15℃以下冰箱中取出试剂盒平衡到室温(20~25℃),注意避免强光照射,待完全溶解后振荡混匀并低速离心 10 s,使用低吸附吸头分液取样,避免试剂损失和浪费。
2.2 根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;样品每满 7 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:
试剂 | 莫氏立克次体(现名伤寒立克次体)反应液 | 莫氏立克次体(现名伤寒立克次体)扩增液 |
用量(样本数为N) | 19μL | 1μL |
2.3 在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂,充分振荡混匀后 2000 rpm 离心 10 s,按照 20 μL/管分装量将试剂分装至八联 PCR 反应管中。
2.4 盖紧八联 PCR 反应管盖, 并注意做好相应标识(请标记在八联 PCR 反应管盖两端突出部位,切勿标记在八联 PCR 反应管盖中间)。将 PCR 反应管转移至样本准备区,剩余试剂放回-15℃以下冰箱冷冻保存。
3. 加样(样本处理区)
将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL,加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心,核酸加样过程中应避免污染。
备注:模板浓度高或存在 PCR 抑制物,需用超纯水稀释模板 DNA,DNA 浓度低于 50ng/ul,可加 5μL 模板,高浓度 DNA 可能抑制 PCR 反应。
4. PCR 扩增(核酸扩增区)
4.1 将待检测反应管置于 PCR 仪反应槽内, 并记录放置顺序;
4.2 推荐循环参数设置:
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 3min |
2 | 35 cycle | 95℃ | 10sec |
58℃ | 15sec | ||
72℃ | 20sec | ||
3 | 1 cycle | 72℃ | 5min |
4 | 1 cycle | 4℃ | Hold |
5. 结果分析判定
5.1 电泳检测
取 10-20 μL PCR 产物。电泳检测 PCR 产物。本产品提供的扩增液在扩增结束后可以直接上样,不需要另外再加 loading buffer。
5.2 电泳结果判断
PCR 产物阳性对照必须有目的片段大小的条带出现,阴性对照必须无任何扩增,否则实验无效。对没有扩增产物的样品,可以稀释 10 倍后重复 PCR 扩增以排除PCR 抑制剂的感染。
6. 检测方法的局限性
Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
Ø 阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
Ø 不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
Ø 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果。
7. 注意事项
Ø 所有操作严格按照说明书进行;
Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,混匀并短暂离心;
Ø 反应液应避光保存;
Ø 反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
Ø 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
Ø 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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