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获取电话禽流感病毒N2亚型荧光RT-PCR 检测试剂盒
产品介绍
【产品名称】禽流感病毒N2亚型荧光RT-PCR 检测试剂盒(荧光RT-PCR法)
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
本试剂盒适用于检测的扁桃体、淋巴结等组织病变部与健康部交界处组织、全血等标本中禽流感病毒N2亚型RNA，适用于禽流感病毒N2亚型感染的辅助诊断。
【检验原理】
本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术，通过设计一对禽禽流感病毒N2亚型特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光PCR技术对禽流感病毒N2亚型的核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
【试剂组成】
名 称 | 规 格 |
酶液 | 50μL×1管 |
N2反应液 | 1100μL×1管 |
N2阳性质控品 | 200μL×1管 |
阴性质控品 | 200μL×1管 |
备注：不同批号的试剂盒组分不宜交叉使用。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融≤5次，有效期12个月。
【适用仪器】
ABI系列 、安捷伦MX3000P/3005P、Bio-Rad等系列荧光定量PCR检测仪。
【标本采集】
病死或扑杀动物，取分泌物、血液、脾脏、扁桃体、肾脏和淋巴结等
【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。
【使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1样本前处理
组织样品：每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中；
全血及血清样本：待血凝固后，取血清100μL于1.5mL灭菌离心管中，进行核酸提取。
棉签采集样本：用超纯水或生理盐水浸泡后，离心后取澄清部分，直接检测无需提取核酸。
其他液体类样本：离心后取澄清部分，直接检测无需提取核酸。
1.2核酸提取
按照相应RNA核酸提取试剂盒进行核酸提取，核酸提取产物-20℃保存。
2. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 | N2反应液 | 酶液 |
用量（样本数为N） | 19μL | 1μL |
3. 加样（样本处理区）
将步骤1提取的RNA、阳性质控品、阴性质控品各取5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
4. PCR扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL；
荧光通道选择： AIV检测通道选择FAM，NDV检测通道选择VIC， 淬灭通道选择NONE，参比荧光选NONE。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1 cycle | 50℃ | 15min | 否 |
2 | 1 cycle | 95℃ | 3min | 否 |
3 | 40 cycles | 15sec | 否 | |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 结果分析判定
5.1结果分析条件设定
5.2设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
5.3结果判断
阳性：检测通道Ct值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。
可疑：检测通道Ct值>35.0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现Ct值≤35.0和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。
阴性：样本检测结果无Ct值且无明显的扩增曲线。
6. 质控标准
阴性质控品：无明显扩增曲线或无Ct值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤30；
以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
7. 检测方法的局限性
样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
【注意事项】
所有操作严格按照说明书进行；
试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
反应液应避光保存；
反应中管盖需盖紧；
使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
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