pMD19-T

PMD19-T

 ● 制品说明pMD19-T Vector 是一种高效克隆 PCR 产物（TA Cloning）的专用载体。本载体由 pUC19 载体改建而成，在pUC19 载体的多克隆位点处的XbaI 和SalI 识别位点之间插入了EcoR V 识别位点，用EcoR V 进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。因大部分耐热性 DNA 聚合酶进行 PCR 反应时都有在 PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高 PCR 产物的连接、克隆效率。由于本载体以pUC19 载体为基础构建而成，所以它具有同 pUC19 载体相同的功能。此外，本制品中的高效连接液Solution I 可以在短时间内（约 30 分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于 Control 反应。本载体与pMD18-T Vector 相比，本制品的β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。● 制品内容（20 次量） pMD19-T Vector（50 ng/μl）20 μl×1 支Control Insert（50 ng/μl）10 μl×1 支Solution I*75 μl×2 支* 使用时请于冰中融解。● 保 存：-20℃● 纯 度■ Control Insert 经克隆后的白色菌落中，有 90%以上含有 Insert DNA 片段。● 用 途■ 进行 TA 克隆，克隆 PCR 产物。■ 对克隆后的 PCR 产物使用BcaBEST Sequencing Primers、M13 Primers 进行 DNA 测序。● pMD19-T Vector 的结构 ● 实验操作■ Control DNA 片段的克隆实验A） 操作方法1） 在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 5 μl。试剂使用量pMD19-T Vector*11 μlControl Insert*21 μl灭菌水3 μl2） 加入 5 μl（等量）的 Solution I。3） 16℃反应 30 分钟。注）① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。4） 全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。5） 42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。6） 加入 890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。7） 在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。8） 挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。■ 一般 DNA 片段的克隆实验1）在微量离心管中配制下列DNA 溶液，全量为 5 μl。试剂使用量pMD19-T Vector*11 μlInsert DNA*30.1 pmol～0.3 pmol灭菌水up to 5 μl-3-2） 加入 5 μl（等量）的 Solution I。3）16℃反应 30 分钟。注）① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。③ 长片段 PCR 产物（2 kb 以上）进行 DNA 克隆时，连接反应时间请延长至数小时。4） 全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。5） 42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。6） 加入 890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。7） 在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。8） 挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。■ 一种可供选择的快速克隆法*41） 在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 5 μl。试剂使用量pMD19-T Vector*11 μlInsert DNA*30.1 pmol～0.3 pmol灭菌水up to 5 μl2） 加入 5 μl（等量）的 Solution I。3） 16℃反应 30 分钟。注）① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。③ 长片段 PCR 产物（2 kb 以上）进行 DNA 克隆时，连接反应时间请延长至数小时。4） 取 2 μl 上述连接液（10 ng Vector DNA）加入到 microcentrifuge tubes 中，冰上冷却 2 min。5） 取 50 μlE.coliJM109 Competent Cell 加入到上述 microcentrifuge tubes 中，混匀并冰浴 5 min。6） 在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养（平板使用前需要在 37℃预热 30 分钟），形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。*1pMD19-T Vector 的使用量取0.5 μl 实验也可得到满意的结果。实际操作时，可按实验需要确定 T 载体的使用量。pMD19-TVector 1 μl（50 ng）的摩尔数约为 0.03 pmol。*2Control InsertControl Insert 为 500 bp 的 3′ 末端带有 A 碱基的 PCR 产物，Control Insert 1 μl（50 ng）的摩尔数约为0.15 pmol。*3Insert DNA 的使用量在进行克隆时，Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔比一般为：1：2～10。*4 快速克隆法该克隆方法的效率会有所下降，但此方法操作简单、迅速，是一快速克隆DNA 片段的方法，可以满足一定客户的需求。-4-● 相关说明1.感受态细胞的选择。转化时请使用高效的热转化感受态细胞（转化效率≥1×108cfu/μg pUC19），这样才可能得到比较理想的阳性克隆。如果需要进行蓝白筛选时，宿主细胞必须具有正确的基因型（F’编码的［LacZ△M15］）产生ω Fragment，才可能和载体 DNA 产生的LacZα多肽相结合，表现出β-半乳糖苷酶活性（α-互补性）。2.Insert DNA 的要求。Insert DNA 应该进行切胶回收的纯化处理后才进行载体连接，尽量避免引物等其它杂质的存在。切胶回收时可使用Takara 凝胶回收试剂盒（Code No. 9762）。3.Insert DNA 使用量的计算方法。进行克隆时，Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔数比一般为 1：2～10，我们可以根据自己的实验情况选择合适的Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔数比。Insert DNA 使用量的计算方法如下：Insert DNA 的使用量（ng）=nmol 数×660×Insert DNA 的 bp 数本载体1 μl（50 ng）的摩尔数约为 0.03 pmol。4.阳性克隆的检测。DNA 片段成功插入至 pMD19-T Vector 中后，一般情况下β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的 DNA片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。有报道称，2 kb 的 DNA 片段插入到载体中后，重组克隆体仍显示了蓝色。所以，当我们没有得到白色菌落时，可以试着检测蓝色菌落。进行阳性克隆检测时，我们建议使用PCR 的方法，扩增用引物可以使用BcaBEST Sequencing Primers，可以对菌体直接进行 PCR 扩增。5.阳性对照实验。为了确认实验操作的正确性以及实验试剂的有效性，我们建议进行阳性对照实验。按照实验操作方法，使用试剂盒中提供的Control Insert，可以进行 10 次阳性对照实验。6.转化效率的计算。取0.1 ng 的 pUC19 Plasmid DNA 加入至 100 μl 的热转化感受态细胞中后，再加入 900 μl 的 SOC培养基（0.1 ng DNA/ml），将上述培养液稀释 10 倍后（0.01 ng DNA/ml）取 100 μl 涂布平板（0.001ng DNA/100 μl），记录菌落数。以得到 200 个克隆体为例计算转化效率，此时的转化效率=200cfu/0.001 ng=2×105cfu=2×108cfu/μg pUC19 DNA。● 使用注意1.Solution I 请于冰中融解。2.克隆时使用的Insert DNA 片段（PCR 产物）建议进行切胶回收纯化，否则 PCR 产物中的短片段DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响 TA 克隆效率。3.按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20 μl。当要转化的 DNA 量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA 后再进行转化。进行乙醇沉淀时使用 Dr. GenTLEPrecipitation Carrier（Code No. 9094）可以提高 DNA 的回收率。4.连接反应请在25℃以下进行，温度升高（>26℃）较难形成环状 DNA。连接效率偏低时，可适当延长连接反应时间至数小时。5.本制品来源于pUC19 载体，因此，适合 pUC19 载体的感受态细胞都可以使用，如：JM109 等。-5-● Q&AQ-1 怎样提高连接转化效率？A-1 1. 确认 Insert DNA 片段的 3’末端是否带有“A”尾。大部分的高保真 DNA 聚合酶（如: TakaraPyrobest、KOD、Pfx、Pfu等）扩增的PCR 产物是平滑末端，不能直接进行 TA 克隆。2. 纯化 PCR 产物。建议使用切胶回收的 PCR 片段，以除去 PCR 产物中的非特异性片段和引物等杂质。进行切胶回收时可以使用Takara 凝胶回收试剂盒（Code No. 9762）。3. 请使用转化效率大于 108cfu/μg pUC19 DNA 的感受态细胞。4. DNA 片段的立体结构、DNA 片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段 DNA 的克隆效率（连接效率与转化效率）偏低，此时可以延长连接反应时间，或采用电转化方法。5. 进行切胶回收纯化 DNA 片段时，不要使 DNA 片段在紫外线下暴露时间过长。6. Solution I 应尽量避免反复冻融。7. 建议使用新配制的平板培养基。Q-2 转化后的菌落全为蓝色，但有目的 DNA 片段的插入，为什么？A-2插入的 DNA 片段较短（小于 500 bp），且插入片段没有影响LacZ 基因的读框，此时平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色（或淡蓝色）。Q-3 欲对克隆 DNA 片段进行测序时，使用何种引物？A-3 本载体来源于 pUC19 载体。因此，用于 pUC19 载体测序的通用引物都可以使用。Q-4 pMD19-T Vector 与 pMD18-T Vector 相比有何不同？A-4 pMD19-T Vector 与 pMD18-T Vector 相比，β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。pMD18-T Vector 连接转化后，一般要经 37℃过夜培养，然后再将其于冰箱内放置一段时间后，其蓝白菌落才能明显呈色。而pMD19-T Vector 涂板培养后一般只需 10 个小时（37℃）便可以呈色。因此，pMD19-T Vector 比 pMD18-T Vector 更适合于蓝白菌落的筛选。