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获取电话在细胞培养中，良好的实验规范和定期检测支原体污染也十分必要。支原体检测的方法有很多种，如直接培养、DNA 荧光染色、ELISA和PCR法等。本产品主要采用PCR方法对各种生物材料（如细胞培养物、实验动物分泌物、动物血清等）支原体感染的检测。通过PCR方法检测培养细胞等生物材料中的支原体，所用引物为根据支原体16S-23S rRNA序列保守区域设计，只特异性扩增支原体 DNA，检出灵敏度与特异性均较高。PCR扩增及电泳分析只需数个小时，操作方便简单。
产品特点
方法学：PCR法
特点：灵敏、特异、快速，操作简便
产品成分
组分编号 | 组分名称 | 规格 | 储存条件 |
-A | Green Taq Mix | 250μl | -20℃ |
-B | ddH2O | 250μl | |
-C | Positive Control Template | 50μl | |
-D | Primers | 50μl |
使用说明
(请详细阅读使用说明后再开始相关实验)
1.待测细胞连续传代3次或培养至两周；
2.细胞达到80% confluency或以上的时候，取1ml上清，进行低速离心（300g，5min，4℃）；
3.离心结束后取950μl上清液，转移至新的无菌EP管中，以去除培养基中的细胞；
4.将上清液高速离心（12000g，10min，4℃），离心结束后，去除900μl上清，剩余50ul用以重悬沉淀（可能肉眼不可见）；
5.将重悬好的沉淀放置4度冰箱，作为PCR的模板备用；
根据下表，配制PCR反应液
试剂 | 实验组 | 阳性对照 | 阴性对照 |
A | 12.5μl | 12.5μl | 12.5μl |
待测样品 | 5μl | / | / |
C | / | 5μl | / |
B | 5.5μl | 5.5μl | 10.5μl |
D | 2μl | 2μl | 2μl |
注：为防止Positive Control Template 污染，请将实验组和阴性对照组加完以后，最后再将C液加入阳性对照组
6.PCR程序
步骤 | 温度 | 反应时间 | 循环数 |
Step 1 | 95℃ | 5min | 1 |
Step 2 | 94℃ | 30s | 5 |
50℃ | 30s | ||
72℃ | 35s | ||
Step 3 | 94℃ | 15s | 23 |
56℃ | 15s | ||
72℃ | 30s | ||
Hold | 12℃ | ∞ | / |
7.制备DNA gel：称取一定量Argrose粉末，用1X TAE buffer配制成1.5%的DNA GEL；
8.待PCR反应结束后，取8-10μl的PCR 反应液（无需要加 loading buffer）直接进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物；
9.目的条带为518bp。示例如下：
推荐使用频率
新细胞进入实验室 | 必检 |
液氮保存前 | 必检 |
定期常规 | 每月一次 |
发现污染后 | 每周一次 |
发现细胞异常 | 随时检测 |