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获取电话NAD 激酶（NADK）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制：
1、 试剂三：用时加入 3 mL 双蒸水，充分溶解，可分装保存，-20℃保存两周，禁止反复冻融；临用前取出一支稀释 100 倍使用。
2、 试剂四：用时加入 1 mL 双蒸水，充分溶解，4℃保存；
3、 试剂五：用时加入 2 mL 双蒸水，充分溶解，4℃保存；
4、 试剂六：用时加入 2 mL 双蒸水，充分溶解，4℃保存；
5、 试剂七：用时加入 2 mL 双蒸水，充分溶解，4℃避光保存；
6、 试剂八：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加入 0.986 mL 蒸馏水充分溶解，可分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
7、 试剂十：自备 95%乙醇；
8、 标准品：加入 1.9 mL 蒸馏水，即得 2 μmol/mL NADP 标品。临用前稀释 100 倍得 20 nmol/mL NADP 标准溶液备用。
产品说明：
NADK（EC 2.7.1.23）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是目前所发现的生物体内唯 一能够催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶，可催化 NAD(H)以 ATP 或无机多聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体进行磷酸化反应，生成 NADP(H)。因此，NAD 激酶在合成 NADP(H)以及调节 NAD(H)与 NADP(H)的平衡上具有重要作用。
NADK 催化 NAD+磷酸化，生成 NADP+；NADP+可被 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为 NADPH；NADPH 通过 PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT），通过其在 570nm 的吸光值大小可反映出 NADK 活性的大小。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、无水乙醇、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、 细菌、细胞或组织样本的制备：
细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 570nm，95%乙醇调零。
2、 标准品的配制：按下表混合试剂三和标准品配制标准品
3、 操作表：（在 EP 管中操作）
充分溶解沉淀后，放于微量比色皿或 96 孔板中在 570nm 下测定吸光值，分别记为 A 测定，A 对照，A 标准，A空白，计算 ΔA 测定=A 测定- A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。
三、NADK活性计算
注意事项：
1. 样本的处理必须在 0℃-4℃中操作完成，以防止酶变性失活。建议在正式实验前，选取差别较大的两个样本进行预实验。
2. 试剂三、四、五、六、七、八在测定过程中都必须在冰上放置。
3. 当初始吸光值大于 0.4 时，建议将样本用 PBS 稀释后测量。
4. 若测量样本数量过多，可以将试剂二、五、六、七按比例配成工作液使用
实验实例：
1、 取 0.1 大鼠肾脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清稀释 2 倍后按照测定步骤操作，使用 96 孔板测得 A测定=0.260，A 对照=0.125，计算 ΔA 测定=A 测定-A 对照=0.260-0.125=0.135，带入标准曲线 y=0.0994x-0.0429，计算 x=（0.135+0.0429）/0.0994=1.7897，按样本质量计算酶活得：
NADK（U/g 质量）=0.067×x÷W×稀释倍数= 0.067×1.7897÷0.1×2=2.3982 U/g 质量。
2、 取小鼠血浆稀释 2 倍直接检测，使用 96 孔板测得 A 测定=0.093，A 对照=0.076，计算 ΔA 测定=A 测定-A 对照=0.093-0.076=0.017，带入标准曲线 y=0.0994x-0.0429，计算 x=（0.017+0.0429）/0.0994=0.6026，按血浆体
积计算酶活得：
NADK（U/mL）=0.067×x×稀释倍数=0.067×0.6026×2=0.0808 U/mL。
特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
