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磷酸化蛋白富集试剂盒是利用磷酸基团与金属的亲和力，采用固定化金属螯合层析（IMAC）的方法富集磷酸化蛋白。可以选择性的对磷酸化蛋白和多肽进行富集和纯化。本试剂盒可以用来提取富集哺各种酵母样本的的磷酸化蛋白。 经本试剂盒制备的蛋白样品可用于Western blotting, mass spectrometry, 2D-PAGE 和protein arrays等下游应用。
保存温度
2-8℃
注意事项
1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！
有效期
一年
检测方法
磷酸化蛋白质谱,2-D,IEF,
WB,IP,EMSA等
适用样本
酵母
产品应用
WB,IP等
仪器准备
1.离心机
2.振荡器
3.匀浆机/匀浆器
4.涡旋混匀器
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒
试剂准备
1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒
耗材准备
1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
使用注意事项：
旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
蛋白样品中不可含Tris。
蛋白样品不可以含有三乙醇胺类的物质。
蛋白样品中可以含有二价阳离子、非离子表面活性剂。
上样蛋白样品pH值必须高于8，最好在8-9，蛋白浓度在0.25-0.5mg/ml。
洗涤细胞和组织是不能用Tris缓冲液。
每个新柱的最大载量约为1mg糖蛋白，使用过的柱子经过再生反复使用的，载量会有下降。
用蛋白柱进行糖蛋白富集，需要离心操作时可以将蛋白柱置于一个50ml离心管离心即可。
最终蛋白样品用于2D电泳前需脱盐。
使用方法
一、蛋白样品的准备：
以下为由酵母细胞制备蛋白样品的参考步骤，其它方法得到的蛋白样品稀释至蛋白浓度为0.25-0.5mg/ml后直接上样即可，确保蛋白样品的pH值低于6。
可以用试剂盒中的洗柱液、裂解液、洗涤液稀释蛋白样品。
酵母细胞裂解：
1. 提取液制备：
每500ul冷的裂解液B中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物和2ul磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 酵母培养物，在4℃，1000g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集酵母沉淀。
3. 用冷生理盐水洗涤酵母细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 每100ul体积酵母沉淀物中加入300-500ul酵母蛋白提取液H，充分混匀。
5. 在37℃或室温条件下轻微振荡45-60分钟。
6. 在1000g条件下离心5-10分钟，弃上清，收集沉淀。
7. 用500ul 生理盐水洗涤沉淀。离心收集沉淀。
8. 沉淀中加入400μl蛋白裂解液B，充分混匀，然后在振荡器上振荡30-40分钟。
9. 在4℃，12000-16000g条件下离心10分钟。
10. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到酵母总蛋白裂解液。
二、柱平衡：
加入500ul洗柱液洗柱，重力作用下或4℃下1000g力离心1分钟甩干吸附柱。
三、上样：
将以上蛋白裂解液或其它待富集蛋白样品加入吸附柱，重力作用下或4℃下1000g力离心1分钟甩干吸附柱。
四、洗柱：
加入300ul洗涤液洗柱，重力作用下或4℃下1000g力离心1分钟甩干吸附柱。重复两次。
五、洗脱：
加入500ul磷酸化蛋白洗脱液，重力作用下或4℃下1000g力离心1分钟甩干吸附柱，收集洗脱液，即得到磷酸化蛋白。
六、柱保存和柱再生：
磷酸化蛋白纯化柱如果保存和处理得当的话可以多次重复使用。
未使用过的柱子直接室温避光保存。
短期保存使用过的柱子置2-8℃避光保存。
长期保存时在柱中加入20%乙醇溶液密封，置2-8℃保存。
载量大幅降低后，需要再生使用的柱子，可以用1ml 0.1M EDTA溶液洗柱，然后在柱中加入20%乙醇溶液密封，置2-8℃保存。
再生使用时，加入0.1M 氯化铁溶液，浸泡蛋白柱填料1小时，即可对蛋白柱进行再生。然后用0.1M乙酸溶液洗柱即可。
特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
