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一键询价产品概述
FDA/PI双染细胞毒性检测试剂盒是利用细胞荧光染料FDA和PI对细胞进行染色,利用FDA标记靶细胞,PI标记死的靶细胞来区分不同的细胞,活的靶细胞成绿色,死的靶细胞成红色(和绿色),从而检测细胞毒性作用。 根据不同的实验方案设计,可以用来检测细胞活性/化合物的细胞毒性作用。也可以用来检测杀伤性T细胞或NK细胞介导的细胞毒作用。 FDA是一种可对活细胞进行荧光标记的染料,可以标记活体细胞。FDA是一种非荧光疏水性荧光素衍生物,它可以通过细胞膜。FDA在结构上将酚羟基部位改造成AM体,所以自身不发荧光,荧光背景低,脂溶性高,能够轻易穿透细胞膜,进入细胞内的FDA的AM部位能被细胞内酯酶水解高荧光产物荧光素的二乙酸酯基团。通过共价结合赖氨酸侧链的氨基而掺入细胞内的蛋白,且结合后发出强的绿色荧光。荧光素分子在具有完整膜的细胞中积累,因此绿色荧光可用作细胞活力的标记。不具有活性代谢的细胞可能不会积聚荧光产物,因此不会显示出绿色荧光。 FDA毒性小,不影响细胞的增殖能力。此方法操作简单,且不用放射性同位素,不存在安全隐患。可以更快速,更准确和更安全地得到想要的实验数据。 FDA/PI标记细胞后通常用流式细胞仪进行细胞毒性检测。 FDA标记细胞呈绿色荧光,荧光波长:λex=496 nm, λem=516 nm。流式检测时的激发波长可以选择488nm,此时的发射波长为516nm,使用流式细胞仪检测时可以采用FL1 detection channel。PI标记细胞呈红色荧光,流式检测时的激发波长可以选择488nm,此时的发射波长为647nm,使用流式细胞仪检测时可以采用FL2 detection channel。 FDA标记的细胞除了流式细胞仪检测细胞毒性外,还可单染后用于细胞增殖检测,或者用荧光酶标板定量活细胞数目,或者用荧光显微镜进行均一染色的细胞示踪观察。 FDA的荧光产物的细胞内保留特性较差,一般2小时保留率低于20%,需要保留特性较好的细胞质染料的可以选择其它货号的产品,例如Calcein AM染料。
保存温度
-20℃避光
注意事项
1.长期不用可以-20℃保存。
2.避免反复冻融。
3.染色液A为DMSO溶液,冬季气温较低时在室温时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解,吸头也需要放在培养箱预热,否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。注意需要加热融解,变成液体状态后离心至管底部再开盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
4.试剂B溶解后需要用吸头吹打混匀。
5.试剂拆封后请尽快使用完!
有效期
6个月
检测方法
1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜
适用样本
1.悬浮细胞
2.贴壁细胞
产品应用
1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜
仪器准备
1.流式细胞仪/荧光显微镜/激光共聚焦
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
试剂准备
1.PBS 2.HBSS
耗材准备
1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
使用注意事项
1.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
2.染色浓度根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。
3.FDA母液极易水解,建议分装保存,分装后用封口膜密封管口,再用锡箔纸包裹,zui后和干燥剂一起用塑料袋密封,≦-20℃冷冻保存。
4.冬天气温较低时FDA溶解液会凝固,可先在37℃水浴至溶解液完全融解后再进行配制,配制过程中注意避免溶液凝固,保持温度至FDA溶解完全。
5.FDA工作液应现配现用,不能提前配制,因为FDA吸水会分解,影响染色效果。
6.FDA易被水解,在水溶液中会很快变质。母液请在使用过程中避免接触水。工作液在标记细胞的过程中和水接触是在许可的时间范围内的。
7.FDA标记细胞仅需5-15分钟即可完成。对于不同细胞,zui佳标记时间需自行摸索。正式实验前,建议先做几个孔摸索染色浓度和加入FDA试剂后的培养时间。
8.荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
9.以下实验步骤仅供参考,请根据实际的实验方案设计或参考相关文献为准。
10.必须设置全阴,FDA单标,PI单标的靶细胞的参照以设置流式。
11.可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的zui佳工作浓度。1) 用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育细胞10min,或者用70%乙醇孵育细胞30min,从而制备死细胞;2) 用50倍-100倍稀释(试剂盒中的母液)的PI溶液进行死细胞染色,以得到仅仅对细胞核染色,而不会对细胞质染色的zui佳工作浓度。3) 用5000倍-500倍稀释(试剂盒中的母液)的FDA进行死细胞染色,以得到不会对细胞质染色的zui佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色,去观察是否活细胞能被染色。
使用方法
细胞模型制备:
1. 收集待检测的靶细胞。
2. 进行相应的毒性药物处理或者效应细胞处理。
细胞FDA染色:
1. 根据需要检测的细胞样品数,用HBSS将FDA母液500-4000倍稀释,配制成FDA染色工作液。不同的细胞需要根据预实验结果确定zui佳染色浓度。如果荧光强度弱,可以适当提高FDA的终浓度。如果背景太高,可以适当降低FDA的终浓度,请摸索条件找到zui佳浓度。
2. 将培养好的待测靶细胞消化后收集,用PBS洗涤2次。
3. 将待测细胞用染色工作液重悬,至细胞浓度大约107/ml。
4. 在37℃培养箱中避光孵育15-30分钟。
5. 孵育结束,500 g离心5分钟。
6. 移除上清液,再次缓慢加入37℃预热的培养基或HBSS重悬细胞。
7. 重复(5),(6)步骤两次。
细胞检测:
1. 收集FDA孵育好的HBSS重悬细胞。
2. 在500ul细胞悬液中加入10ul PI染色液,混匀。
3. 在2-8℃避光孵育2-10分钟。
4. 在400g离心5分钟收集细胞。
5. 用500ul HBSS或PBS重悬细胞。
6. 取500ul细胞悬液,用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
7. 根据流式结果计算死亡细胞百分率。被杀伤死亡的靶细胞被PI染上会出现在FDA+PI+区域,未杀伤的在FDA+PI-区域,得出被杀伤的靶细胞的比例。用这个比例再计算毒性。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!