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Porcine Transmissible Gasteroenteritis Virus(TGEV)RT-PCR Kit
产品及特点：
猪传染性腹泻病毒(Porcine Transmissible Gasteroenteritis Virus，TGEV)是一种RNA病毒，会引起猪流行性腹泻，是一种急性肠道传染病。本病与传染性胃肠炎很相似，在我国多发生在每年12月份至翌年1～2月，夏季也有发病的报道。可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越重，死亡率高，给养殖业带来较大的经济损失，因此猪传染性腹泻病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本产品基于PCR原理开发。它具有下列特点：
1.一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
2.根据猪传染性腹泻病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
3.基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。
4.使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
本产品足够50次30μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。
规格及成份：
成分 | 编号 | 十孔盒包装 |
2×qPCR MagicMix | A | 500μL（棕色管） |
荧光 PCR 专用模板稀释液 | B | 1 mL（黄盖） |
猪传染性腹泻病毒PCR 引物混合物 | C | 100μL（白盖） |
猪传染性腹泻病毒PCR 阳性对照(1×10E8 拷贝/μL) | D | 50μL（红盖） |
DNA 病毒裂解液 | E | 15 次（9 mL） |
使用手册 | F | 1 份 |
运输及保存 ：低温运输、-20℃保存，有效期一年。
自备试剂 ：DNA 模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。
使用方法 一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）
1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。
2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。
4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
8. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的 PCR 阳性对照的第 4号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）或第 5 号（浓度为 1×10E5拷贝/μL，10μL 相当于 10 万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。如果每次制备需要 200μL 样品，则 PC 和 NC 的体积也必须是 200μL。
9. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。本试剂盒免费赠送 15 次一管式病毒 DNAout，其使用手册可从本公司网站。
三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）
10. 如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于 PCR 阳性对照。如果做 2-3 次重复，则反应设置数量相应增加 2 或 3 倍。
11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加）：
成分 | 样品管 N+2 个 | PCR 阴性 对照管 | PCR 阳性 对照管（2-7 管） |
2×qPCR MagicMix （棕色管） | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
猪传染性腹泻病毒PCR 引物混合液（白盖） | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
自备 10×ROX (见注) | 2 μL | 2 μL | 2 μL |
N+2 待测样品 DNA 模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
第 7 步所得 PCR 阳性对照稀释液（2-7 号） | 不加 | 不加 | 各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…） |
注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。
12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 95℃ | 5 min |
| 95℃ | 15 sec |
60℃
| 1 min，（采集 SYBR 通道的荧光信号）
| |
按仪器预设程序进行熔解曲线分析 | ||
13. 数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时，吸收光谱在 471 nm，结合 DNA 时的吸收光谱在 500 nm，发射光谱在 530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。
四、数据处理
14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的log 值，再推算出其浓度。
15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。
特别提示：本公司的所有产品仅用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
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