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钦诚生物 | 一周
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名称 | 规格 | 价格 |
Vitale辣根过氧化物酶法过氧化物酶显色试剂盒 | 100次 | 1990 |
运输:常温 保存:常温 有效期:1年 货期:3-5天 |
实验原理:
抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性,免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来,以此作为抗原或半抗原,通过免疫动物后获得特异性的抗体,再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的,因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来,以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性,定位或定量的研究。
Vitale辣根过氧化物酶法过氧化物酶显色试剂盒实验步骤:
(一)脱蜡和水化:
(二)抗原修复:
(三)免疫组化染色SP法
(四)SABC法
免疫组化问题解答
1、染色过强
a 抗体浓度过高戒孵育时间过长 。降低抗体滴度、抗体孵育时间:室温1小时、或4度过夜
b 孵育温度过高超过37度。 一般在室温20-28度 c DAB显色时间过长戒浓度过高 显色时间不超过5-12分钟,以显微镜下观察为准。
2、非特异性背景染色
a 操作过程中冲洗不充分 :每步冲洗3次每次5分钟。
b 组织中含过氧化物酶未阻断:可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长。
c 组织中含内原性生物素:正常非免疫动物血清再封闭。
d 血清蛋白封闭不充分:延长血清蛋白封闭时间。
3、染色弱
a 抗体浓度过低、孵育时间过短:提高抗体浓度、孵育时间不能少于60分钟。
b 试剂超过有效使用时间:应更换试剂。
c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干:每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释(应防止切片干燥)。
d 室温太低:低于15度,要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟,或4度冰箱过夜。
e蛋白封闭过度:封闭不要超过12分钟。
4、染色阴性
a 操作步骤错误:应重试、设阳性对照。
b 组织中无抗原:设阳性对照以验证试验结果。
c 一抗不二抗种属连接错误:仔细确定一抗二抗种属无误。
免疫组化技术的关键问题
1.组织处理
2) 组织脱水、透明、浸蜡
2.切片
2)明胶硫酸铬钾法
3)APES (3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)
3.免疫组化染色
2) 根据每一种抗体的要求,对组织抗原进行相应的修复。
3) 每张切片加1滴或50ul过氧化酶阻断溶液(试剂A),以阻断内源性过氧化物酶的活性,室温下孵育10分钟。
4) PBS冲洗3×3’。
5) 甩去PBS液,每张切片加1滴或50ul的非免疫性动物血清(试剂B),室温下孵育10分钟。
6) 甩去血清,每张切片加1滴或50ul的抗体(用户自选),室温下孵育60分钟戒4℃过夜,建议参阅每种抗体的说明书。
7) PBS冲洗3×5’。
8) 甩去PBS液,每张切片加1滴或50ul生物素标记的第二抗体(试剂C),室温下孵育10分钟。
9) PBS冲洗3×3’。
10)甩去PBS液,每张切片加1滴或50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D),室温下孵育10分钟。
11)PBS冲洗3×3’。
12)甩去PBS液,每张切片加2滴或100ul新鲜配制的DAB或AEC溶液,显微镜下观察3-10分钟,阳性显色为棕色或红色。
13)自来水冲洗,苏木素复染,0.1%HCL分化,0.1%氨水或PBS冲洗返蓝。
14)如果用DAB显色,则切片经过梯度酒精脱水干燥,(二甲苯透明),中性树胶封固;如果用AEC显色,则切片不能经酒精脱水,而直接用水性封片剂封片。
Vitale辣根过氧化物酶法过氧化物酶显色试剂盒免疫组化染色注意事项
免疫组化染色方法已不是什么很难的问题,操作步骤简单也易掌握,但要染好免疫组化,其中方法的技巧将是每位操作者在实际工作中不断摸索和探讨的事,但最基本的应从以下方面加以注意:
(1)去除内源酶及内源性生物素
1) 去除内源酶
2) 去除内源性生物素
3)灭活碱性磷酸酶
(2)抑制非特异性背景着色
(3)缓冲液
(4)抗原修复
免疫组化染色
一.石蜡切片免疫组化染色实验步骤:
1.石蜡切片脱蜡至水:(石蜡切片染色前应置60℃ 1小时)。
2.过氧化氢封闭内源性过氧化物酶:3%H2O2,室温10分钟(避光)。
3.蒸馏水洗:5分钟,2次(置于摇床)。
4.抗原修复:根据待检测的抗原,选择适当的方法。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!