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农杆菌GV3101化学感受态细胞
E.coli GV3101 Chemical Competent Cell
本产品为GV3101农杆菌化学感受态细胞,其具有利福平和庆大霉素抗性,适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作,经pCAMBIA2301质粒检测转化效率高达104cfu/μg。
基因型:C58(rifR)Ti pMP90(pTiC58DT-DNA)(gentR/strepR)Nopaline。
储存条件:干冰运输、-80℃保存,有效期一年。
自备试剂:质粒DNA、液氮等
使用方法:
转化前准备
1. 冰水浴和37℃水浴。
2.液氮或干冰/乙醇混合物。
3. 将抗性平板在 28℃培养箱中平衡至少15分钟。
转化方法
1. 取-80℃保存的农杆菌感受态细胞于冰水浴中融化。
2. 无菌条件下,向刚刚融化的感受态细胞悬液中加入需要转化的质粒,每100μL感受态细胞加1μg质粒DNA,轻柔混匀。冰水浴中静置10分钟。
3. 将离心管置于液氮中速冻 5分钟(注:也可以用干冰和无水乙醇混合物替代液氮)。
4. 迅速将离心管置于37℃水浴静置中5分钟,不要晃动水面。然后快速转至冰水浴中静置5分钟。
5. 加入800μl 无抗生素的2×YT或LB液体培养基,28-30℃振荡培养2~3小时。使菌体复苏,表达抗性。
6. 5000rpm离心1分钟收菌,保留100μl左右上清,轻轻吹打重悬菌体,均匀涂布到含有相应抗生素的LB 固体培养基平板上,待平板中的液体完全吸收后,倒置平板,28-30℃培养48-72小时。
?注:当平板只含有50μg/mL kan时,28℃培养48小时即可;平板中同时加入50μg/mL kan,20μg/mL rif时,需 28℃培养 60h;如果使用的平板含有50μg/mL rif 则需要 28℃培养 72-90小时。
注意事项:
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10 ;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
2. 混入质粒时应轻柔操作。
3.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
4. 利福平浓度不应高于25μg/μL,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有 50μg/mL kan,若所用平板含有 20μg/mL rif 则转化效率降低到1/2。
5.培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止 Ti质粒丢失,但链霉素不利于农杆菌的转基因操作,所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素,Ti质粒丢失的概率极低(可以忽略)。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!