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酿酒酵母AH109化学感受态细胞
E.coli AH109 Chemical Competent Cell
AH109菌株来源于PJ69-2A 酵母菌株,将lacZ 报告基因引入PJ69-2A 诞生了AH109,此菌株是Clontech公司开发的GAL4 系统酵母双杂实验用菌株,MATa型,可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187 通过mating 操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker 为: trp1,leu2,报告基因为:lacZ,HIS3,ADE2,MEL1。AH109-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用:PGBKT7和PGADT7。质粒PGBKT7的筛选标志为TRP1,用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N 端1~174 位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白;质粒PGADT7的筛选标志为LEU,用于表达AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。
?GAL4系统原理:一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域:位于N 端1 ~174 位氨基酸区段的DNA 结合域(DNA-BD)和位于C 端768 ~881位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD 能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS,并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD 单独存在不能激活转录,但当二者接近时,则呈现完整的GAL4活性,使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下,BD 不与AD 结合,将要检测的蛋白质分别与BD和AD 融合,形成 bait 融合蛋白(bait -BD)和prey 融合蛋白(prey-AD),如果 bait和prey发生相互作用,就会促使 BD和AD的相互接近,形成完整的GAL4,从而激活报告基因的转录。AH109 有四个报告基因:lacZ,HIS3,ADE2,MEL1,分别由三种不同的启动子(GAL1,GAL2,MEL1)启动,这三种启动子只有GAL4 识别的17bp 核心区相同,其余部分均不同,大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。本产品经特殊工艺制作而成,经PGADT7质粒检测转化效率为>104cfu/μg DNA。
菌株基因型:MATa,trp1-901,leu2-3,112,ura3-52,his3-200,gal4Δ,gal80Δ,LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3,MEL1 GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2,URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ
产品组成:
储存条件:感受态细胞干冰运输、-80℃保存,Carrier DNA -20℃保存;PEG/LiAc 4℃保存;有效期半年。
自备试剂:目的DNA、YPDA、 SD培养基等。
使用方法:
1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl,可以根据实际情况分装使用。
以下实验以100μL感受态细胞为例。
2. 待感受态细胞融化后,向感受态细胞悬液中依次加入2-5μg预冷的目的质粒、10μLCarrier DNA(95-100℃ 5分钟,快速冰浴,重复一次)、500μl PEG/LiAc,吹打混匀,30℃水浴30分钟(15分钟时翻转6-8次混匀)。
3. 42℃水浴15分钟(7.5分钟时翻转6-8次混匀)。
4. 5000rpm离心 40秒,弃上清。取400μl ddH2O 重悬沉淀,5000rpm离心 30秒,弃上清。
5. 取50μl ddH2O 重悬沉淀,涂板,29℃培养48-96小时。
注意事项:
1. 酵母菌株对高温敏感,最适生长温度为27-30℃;高于31℃,生长速度和转化效率呈指数下降。
2.菌落变粉不是污染,是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后,平板上的Adenine 被酵母消耗完毕,酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破坏,Adenine 合成途径受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中间产物P - ribosylamino imidazole(AIR)在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
3. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢,培养基中缺陷成分越多,生长越慢,以转化涂板为例:涂YPDA 平板29℃,48h培养可见直径1mm 克隆;涂SD 单缺平板29℃,48-60h培养可见直径1mm 克隆,涂SD 双缺平板29℃,60-80h培养可见直径1mm 克隆,涂SD 三缺或四缺平板29℃,80-90h培养可见直径1mm 克隆。
4.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
5. 同时转化2-3 种质粒时可增加质粒的用量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!