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通用型RT-LAMP恒温扩增试剂盒
Universal RT-LAMP Kit
产品及特点 本 试 剂 盒 可 以 用 于 RT-LAMP 等 温 扩 增 ， RT-LAMP 即 逆转录和Loop-Mediated Isothermal Amplification（环介导等温扩增）的结合，专门用于快速扩增 RNA。LAMP 是 2000 年才出现的一种新颖的等温核酸扩增方法。它利用 4 或 6 条模板专一的特异引物和具有链置换能力的 DNA 聚合酶，在等温条件下(63℃左右) 30－60 分钟完成扩增。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于 RT-PCR 技术，同时还不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，不依赖任何专门的仪器设备。目前已成功应用于人类及动植物、细菌、病毒、寄生虫、真菌等病原体的快速检测。本试剂盒即根据 LAMP 原理开发，它具有下列特点：
1. 整合了所有成分为 2×RT-LAMP Mix，不需要单个准备各成分。RT 和LAMP 一管式操作，方便快捷，减少污染。
2. 高特异性，由于同时使用 4-6 条特异引物，所以特异性比 RT-PCR 更高。
3. 高扩增效率，扩增效率可达到 10E9-10E10，比 PCR 灵敏 10 倍，最好时可检测到单拷贝的 RNA 分子
4. 65℃左右恒温下完成 RT 和 LAMP 扩增，不需要贵重的热循环仪。。
5. 提供扩增对照，便于在遇到困难时分析原因。
6. 本产品足够 50 次 20uL 体系的 RT-LAMP 扩增，本产品仅限于科研使用。
运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂 RNA 模板及 LAMP 引物（4 或 6 条）
使用方法 1. 配制自备的5×LAMP引物混合液。
先加超纯水将自备的下列6种（或4种）引物干粉稀释到母液浓度（见下表），然后在一新的离心管中按表中所列体积加入各种引物和超纯水，最后得到1mL的5×LAMP引物混合液。如果需要配制的5×LAMP引物混合液体积大于或小于1mL，则各成分的用量请按比例调整。此混合液可以在-20℃
放置2年。1mL的5×LAMP引物混合液足够250次20uL体积的LAMP或RT-LAMP扩增。
引物名称 母液浓度 加入母液量 在 5×LAMP 引物混合液中的浓度
自备 FIP 引物 100 uM 80 uL 8 uM
自备 BIP 引物 100 uM 80 uL 8 uM
自备 F3 引物 100 uM 10 uL 1 uM
自备 B3 引物 100 uM 10 uL 1 uM
自备 Loop F 100 uM 20 uL 2 uM
自备 Loop B 100 uM 20 uL 2 uM
超纯水 780 uL
合计 1000uL
2. 在冰上融化各组份后轻柔混匀，按下表在PCR反应管中设置反应，如果有N个样品，则需要设置N+2个反应，多的两个一个是阳性对照，一个是阴性对照：成份 N 个样品管 阴性对照管 阳性对照管
2×RT-LAMP Mix 各 10 uL 10 uL 10 uL
自备 5×LAMP 引物混合液 各 4 uL 4 uL
自备 RNA 模板 各 1-100ng -
LAMP 阳性对照模板-引物混合物- - 4.5
补自备超纯水到 20 uL 20 uL 20 uL
注：如果在此步少加1 uL水，然后加入自备的可视化染料（本公司PCR级绿如蓝染料，产品编号70909，另售），则反应后可直接肉眼判断LAMP扩增是否成功。
3. 混匀，置于63℃保温60分钟。注意：如果不使用Loop引物，则最好保温120分钟；如果使用Loop引物，则最好保温60分钟。
4. 80℃10分钟灭活Bst DNA聚合酶。BstDNA聚合酶有外切酶活性，所以必须灭活，否则它可能会逐渐降解DNA扩增产物。
5. 产物置于-20℃备用或立即用于下游检测。扩增产物可选下列方法之一检测:
1) 如果已经加入LAMP可见光染料，则直接肉眼观察。判断标准见下。
2) 琼脂糖凝胶电泳：取LAMP扩增产物5uL在1-2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，如果有扩增将可见LAMP特征性梯状电泳图谱；
3) 向扩增产物中直接加入PCR级绿如蓝染料10 uL，混匀，稍离心。如果颜色同阴性对照呈现淡黄色，则无扩增。如果同阳性对照呈现淡绿色，表示有LAMP扩增。也可在加入PCR级绿如蓝染料后将反应管在300nm的紫外线下观察，如果颜色同阴性对照呈现弱荧光，则无扩增。如果同阳性对照呈现强荧光，表示有LAMP扩增。
6. 结果分析：
1) 如果阳性对照有扩增，阴性对照没有扩增，则样品数据才有效，否则实验失败，不需要分析数据。
2) 如果阳性对照没有扩增，说明试剂盒有问题，请速跟厂家联系。
3) 如果阴性对照有扩增，说明有污染（过去的扩增产物污染了阴性样品），必须重新设计新的针对不同靶位点的LAMP引物，并且严格注意操作的规范性。
特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
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