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DNA Shuffling试剂盒
DNA Shuffling Kit
产品及特点 DNA Shuffling 即 DNA 分子的体外同源重组,它是一种分子水平上的定向
进化(directed evolution)技术,它以一个或多个基因为起始材料,通过先随机
断裂成小片段,再进行互为模板和引物的 PCR(无外加引物),最后再进行常规
PCR(外加引物)等处理,最后得到含有大量 DNA 重组突变的 PCR 产物。
1. 即开即用,用户只需要提供样品 DNA 模板,无需单独准备各成分。
2. 可以用于对长度在 1000bp 的同源片段进行 shuffling。
3. 操作手册经过优化,1-2 天即可完成,节省大量优化时间。
4. 本产品足够 10 次 DNA Shuffling 反应,只适用于科研,不能用于临床。
运输及保存 低温运输,-20℃保存,保存期限一年。
自备试剂 待突变基因片段、DNA Shuffling 引物(第二轮 PCR 引物)、胶回收试剂盒。
使用方法
1. 提前开启 37℃和 75℃水浴或金属浴。
2. 待突变基因片段的制备:待突变基因片段可以用多个含同源片段的质粒为模板、用 PCR 法或酶切法制备。制备时需保证含起始同源片段(或此同源片段的一部分)的 DNA 片段总长度要比 DNA shuffling 终产物(第二轮 PCR产物)长 200-400 bp,即第二轮 PCR 的引物位置要在此步模板制备引物内侧 100-200bp,第二轮 PCR 产物的长度在 1000bp 以下。每次 DNAShuffling 实验至少需要 2 μg 起始同源片段(如果含两个以上同源片段,则彼此的比例为 1:1:1),最多可以使用 5 μg 起始同源片段,并且必须通过胶回收的方法回收,以便彻底去除残留的质粒模板、引物和非特异扩增产物等(如果不去除此步的引物,其将对后续 PCR 造成严重干扰)。最后需用分光光度法准确定量,此溶液即为同源片段,放冰上待用。
3. 准备 DNase I 工作液,将 1 μL 本试剂盒提供的 DNase I 溶液、8uL 超纯水、1 μL DNA Shuffling 试剂盒溶液 A 混合得 DNase 工作液,放冰上待用。DNase 工作液必须现配现用。
4. 设置同源片段碎片化反应:在一个 PCR 管中
5. 充分轻柔吹打混匀后 37℃水浴 8 分钟,然后立即放 75℃水浴处理 10 分钟以灭活 DNase I。
6. 在 2-3%琼脂糖凝胶上电泳,用常规的胶回收法回收 25-150 bp 范围的所有片段,分光光度法精确测定回收片段的浓度。此即为回收片段,放冰上待用。注意:一定要加合适的 DNA marker 以便确定片段范围。
7. 回收片段重组反应:在一干净 PCR 管中加入 0.5 μg 回收片段、50 μL PCRMix 3.0、补加超纯水到 100 μL。反应总体积为 100 μL
8. 按下面的 PCR 反应参数进行第一轮无引物 PCR:
过程 温度 时间
PCR 前变性 94℃ 150 s
PCR 反应
(40 循环)
94℃ 30 s
47.5℃ 45 s
72℃ 10 s,每次循环后增加 5s
9. 取 5-10 μL 进行电泳检测(本 PCR Mix 含上样成分,可以直接上样。红色
示踪剂的泳动速度相当于 50bp DNA),然后对预期长度区域的 PCR 产物
进行回收(如果 Shuffling 的同源区域长度为 800bp,则回收 600-1000bp
范围的片段),得到第一轮 PCR 回收产物。
10. 留部分第一轮 PCR 回收产物之后,用超纯水将其分别稀释 10 倍、20 倍和
50 倍,放冰上待用。
11. 取第一轮 PCR 回收产物原液、10 倍稀释液、20 倍稀释液和 50 倍稀释液各 1uL 作为 PCR 模板,按下表设置 4 管第二轮 PCR 反应(100μL 体系)。成分 1-4 号管
PCR 模板(4 种) 各 1 μL(1 号加原液、2 号加 10
倍稀释液、以此类推)
PCR MagicMix 3.0 50 μL
自备 DNA Shuffling 引物 每管各加 30 pmol
超纯水 加到 100 μL
12. 按下列 PCR 参数进行 PCR:
过程 温度 时间
活化 94℃ 150 s
PCR 反应
(25 次循环)
94℃ 30 s
47.5℃ 45 s
72℃ 60 s,每次循环后增加 5s
PCR 后延伸 72℃ 10 min
13. 电泳检测 4 个 PCR 产物,回收预期大小的 PCR 产物(根据引物位置估计预期大小),用于后续克隆和分析实验(略)。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!