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DNA5’末端标记试剂盒
DNA 5’ End-Labeling Kit
产品及特点 本产品为 DNA 5’末端标记系统，利用 T4 Polynucleotide Kinase（T4 多聚核苷酸激酶）和［γ-32P］ATP 对粘性末端或平末端的 DNA 或 RNA 的 5’ 末端进行高效标记反应。
本产品具有下列特点：
1. 使用本试剂盒之前，不需要对 5’末端的磷酸基团进行去磷酸化处理，因为使用的 kinase 能使 5’末端的磷酸与[γ-32P]ATP 的γ-磷酸进行交换。
2. 合成的单链或双寡核苷酸的 5’末端游离的 OH 基团都能通过 Kinase 反应被标记（或者只是简单的磷酸化）。
3. 提供的两种反应液使交换反应和磷酸化反应都能高效进行，均能得到大于106 cpm/pmol（5’-end）的比活性。
运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂 DNA 片段、［γ-32P］ATP 或其它的标记、未标记的 ATPs、牛小肠碱性磷酸 酶（CIAP）等
使用方法 一、交换反应
1. 实验前需自备的试剂：7 M 醋酸铵、100%乙醇、70%乙醇等
2. 在微量离心管中制备下列反应液：
3. 37℃反应 30 分钟。
4. 70℃加热 5～10 分钟使酶失活。
5. 加入 10 μL 的 7 M CH3COONH4（pH 4.5）。如使用 CH3COONa 做乙醇沉淀时使其终浓度达 300 mM。
6. 加入 87.5 μL（2.5 倍）的冷无水乙醇，-20℃放置 30～60 分钟。
7. 离心回收沉淀，用 70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
8. 用适当 Buffer 溶解沉淀。
注：通过第 5～8 步操作几乎可以除去大部分未反应的[γ-32P] ATP，如要完全将其除去时，乙醇沉淀后用凝胶过滤等方法精制即可。如需用苯酚抽提除去蛋白质时，请在第 8 步之后进行。
二、磷酸化反应标记
A. 去磷酸化反应
1. 实验前需自备的试剂：TE 饱和酚/氯仿、3 M NaCl 、100%乙醇、70%
乙醇、牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）等
2. 在微量离心管中制备下列反应液：
成分 加入的体积
自备的 DNA 片段 133 μL(≤10 μg)
1 M Tris-HCl，pH 8.0 15 μL
牛小肠碱性磷酸酶
（CIAP，10~20 U/μL）
2 μL
灭菌的超纯水 补足到 150 μL
3. 50℃反应 30 分钟。
4. 加入 150 μL 的 TE 饱和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），充分混匀。
5. 离心，取上层（水层）移到另一个微量离心管中。
6. 重复操作 4～5。
7. 加入 7.5 μL 的 3 M NaCl（最终浓度 150 mM）。
8. 加入 375 μL（2.5 倍量）的冷无水乙醇，-20℃放置 30～60 分钟。
9. 离心回收沉淀，用 1 mL 70%的冷乙醇清洗后，沉淀真空干燥。
10. 使用 20 μL 的 TE Buffer 溶解沉淀。
B. 磷酸化反应（前反应）
1. 在微量离心管中制备下列反应液：
成分 加入的体积
自备的 DNA 片段 20.5 μL(≤5 pmoles 的 5′末端)
10×磷酸缓冲液 2.5 μL
[γ -32P] ATP 1 μL
T4 多聚核苷酸激酶（10 U/μL） 1 μL
灭菌的超纯水 补足到 25 μL
2. 37℃反应 30 分钟。
3. 下面的操作与交换反应的第 4-8 步操作相同。
三、合成 DNA 寡核苷酸的标记
1. 在微量离心管中制备下列反应液：
成分 加入的体积
Oligonucleotide DNA with free
5’-OH(5～10 pmoles)
≤3 μL
10×磷酸缓冲液 2.5 μL
[γ -32P] ATP 1 μL
T4 多聚核苷酸激酶（10 U/μL） 1 μL
灭菌的超纯水 补足到 25 μL
2. 37℃反应 30 分钟。
3. 下面的操作与交换反应的第 4-8 步操作相同。
四、合成 DNA 寡核苷酸的标记
当掺入水平很低的时候，需要使用本步骤，即通过体积排阻色谱或过滤试剂盒除去未反应的标记。Sephadex G-50 层析柱（需另购）对于去除未掺入的 dNTPs 效果很好，它还能大幅减少小于 20 个碱基的 DNA 寡核苷酸和小于20 bp 的双链 DNA 的量。使用之前需要在 70℃加热 5～10 分钟以使 T4 多聚核苷酸激酶失活。Sephadex G-25 层析柱可以用来纯化长度不小于 10 个碱基的寡核苷酸。
特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
