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革兰氏阳性细菌质粒DNA提取试剂盒（革兰氏阳性细菌质粒DNAout）
G+ Bacteria Plasmid DNAOUT
产品及特点 本试剂盒是用于从革氏阳性（G+）细菌种小量制备质粒 DNA。本产品基于改良后 的碱变性法，首先菌体经溶菌酶破壁，然后碱裂解法处理使基因组 DNA 和质粒 DNA 均变性，再用酸中和，质粒 DNA 客户快速复性，而基因组 DNA 不能快速复性，故 可以通过离心去除，除去后含质粒的上清用离心吸附柱吸附质粒 DNA，洗去杂质， 即可得到纯化的质粒 DNA。本产品具有下列特点：
1. 快速、步骤少，整个操作在 40 分钟左右完成。
2. 不需要预平衡离心吸附柱。
3. 通用洗柱液即开即用，不需要用户额外加乙醇。
4. 溶液 B 中有蓝色染料，便于目测非常关键的碱变性和中和反应两步的溶液混匀状况，保证实验效果。
5. 产量高，一次可以处理 1-4 mL 过夜培养的 G+菌液，每毫升过夜培养的 G+细菌可以提取到 2-5 ug/mL（取决于质粒是高拷贝、中拷贝还是低拷贝）。
6. 纯度高，采用本试剂盒提取的质粒 OD 比值在 1.8-2.0 之间，可以直接用于酶切、转化、测序及 PCR 等。
运输及保存 常温运输和保存，RNase A 溶液需要-20℃保存，有效期一年。
自备试剂 无。
使用方法1. 从筛选平板上挑取单菌落至含抗生素的培养基中，37℃震荡培养 12-16 小时（摇
床转速 200-300）。注意：建议使用 LB 培养基，营养更丰富的培养基会使菌体浓度过高，超过纯化系统处理能力而降低 DNA 质量。另外，延长培养时间会因细胞死亡、裂解而造成质粒 DNA 浓度降低。
2. 用 1.5 mL 离心管收集 1-4 mL 过夜培养饱和菌液，室温 12,000 rpm 离心 1分钟，弃上清，再短暂离心，吸弃残留液体。
3. 第一次使用本试剂盒时，先将全部 RNase A 溶液全部加入到革氏阳性质粒DNAout 溶液 A（简称溶液 A，下同）中，摇匀后再取用，未用完的溶液 A 放 4℃保存。
4. 加入 250 uL 溶液 A，用枪头充分吹打使菌体重悬。注意：细胞未充分悬浮会影响后续碱变性，可以使用漩涡振荡器混匀或使用枪头吸头吹打沉淀至完全混匀。
5. 加入大约 5 mg 溶菌酶干粉（用 0.1mg 精度的分析天平称量），轻柔颠倒混匀后室温放置 10 分钟破裂细胞壁。
6. 加入 250 uL 革氏阳性质粒 DNAout 溶液 B（下面简称溶液 B，如果溶液 B 在低温放置产生沉淀，须 37℃加热溶解后冷却到室温方可使用），温和反复颠倒混匀看到溶液的蓝色变得均匀并且溶液变粘即可（一般需要颠倒 4-6 次），然后冰上放置不超过 5 分钟。注意：冰上放置不要超过 5 分钟，否则质粒 DNA 会有碱损伤。千万不要剧烈振荡，否则基因组 DNA 断裂产生的片段非常容易污染质粒DNA。溶液 B 用后需要将盖拧紧存放，否则空气中的二氧化碳会进入溶液，形
成碳酸，中和溶液 B 中的碱，降低其效率。如果溶液 B 颜色不是蓝色，则表示变质，应该弃之不用并且速跟厂家联系。
7. 加入 350 uL 冰上预冷的革氏阳性质粒 DNAout 溶液 C（下面简称溶液 C），温和反复颠倒直到溶液颜色变成无色（一般需要颠倒混匀 4-6 次）。混匀后可见白色沉淀物产生，然后冰上放置至少 5 分钟让质粒 DNA 复性。
8. 12,000 rpm 离心 3 分钟，小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的溶液比重较大，部分沉淀物悬浮在上清液中属正常，吸取上清时避开漂浮的沉淀物即可。如果此步的离心在 4℃进行，可减轻沉淀物漂浮。
9. 静置 2 分钟以让质粒 DNA 与离心吸附柱充分结合，保证静置不少于 2 分钟十分重要。
10. 室温 12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管中的废液。
11. 加入 500 uL 的通用洗柱液到离心吸附柱中，室温 12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管中废液。注意：通用洗柱液中含乙醇，每次用后需要将盖拧紧存放，否则乙醇会挥发。
12. 重复上步 1 次。
13. 室温 12,000 rpm 离心 1 分钟，甩干残留液体。此步不能省略，否则残留乙醇会影响 DNA 的后续使用（如残留乙醇使 DNA 溶液在电泳上样时不能沉淀到加样孔中）。
14. 将离心吸附柱置于一个新的 1.5 mL 塑料离心管（自备）中，加入 30-100 uL65-80℃预热的 DNA 洗脱液 2.0，室温放置 2 分钟。常温的 DNA 洗脱液 2.0也可以用于洗脱，但产量稍微有所降低。
15. 室温 12,000 rpm 离心 1 分钟，离心管底溶液即质粒 DNA。
16. 由于基因的吸附柱结合 DNA 能力较强，如果再加适量 DNA 洗脱液 2.0 到离心吸附柱中，往往还能洗脱下很多质粒 DNA（相当于第一次洗脱的 20-30%），但注意不要使用上步得到的 DNA 洗脱液 2.0 来洗脱。
特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
